坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)感染是2010年在我国出现的一种新发的病毒性传染病,以产蛋鸭产蛋率严重下降和雏鸭出现神经症状为主要特征,疫苗免疫是预防和控制该病的重要措施之一。TMUV弱毒疫苗因其具有免疫次数少、免疫产生快和免疫力持久等优势,成为生产实践中应用较为广泛的疫苗。然而有些鸭场的鸭群在接种了TMUV弱毒疫苗后,仍有部分鸭只发生坦布苏病毒病,因此对于TMUV弱毒疫苗在实际使用过程中的免疫保护效果还存在较多的疑问。此外,目前对TMUV弱毒疫苗免疫保护效果的研究主要集中在产蛋鸭,有关TMUV弱毒疫苗对雏鸭的免疫保护效果的相关报道较少。因此,本研究对分离到的TMUV进行变异分析,以研究现行的TMU V弱毒疫苗对流行毒株是否还具有免疫保护能力;同时将现行的一种TMUV弱毒疫苗经不同免疫途径免疫不同日龄雏鸭,研究免疫日龄及免疫途径的改变是否可以对TMU V弱毒疫苗的免疫保护效果产生积极影响,为坦布苏病毒病防控过程中安全有效的使用弱毒疫苗提供理论依据。本研究在2017~2019年间,自山东、四川、安徽等地区采集疑似TMUV感染的鸭病料,利用细胞培养、RT-PCR等方法进行病毒的分离和鉴定,共获得21株TMU V。对TMUV毒株进行E基因扩增和序列测定,并对其E基因进行遗传进化分析。结果表明,本研究分离到的21株TMUV毒株均属于中国分离株Ⅱ(TMUV优势株),且与之前分离的位于该分支上的TMUV亲缘关系很近,同源性较高,可见TMUV主要基因没有发生明显的变异,说明TMUV弱毒疫苗对流行毒株仍具有免疫保护能力。对1日龄、3日龄、5日龄、7日龄樱桃谷雏鸭通过肌肉注射途径和口服途径免疫TMUV弱毒疫苗,肌肉注射免疫剂量为0.5 mL/羽,口服免疫剂量分为0.5 mL/羽和0.8 mL/羽两种。免疫后每天观察雏鸭的临床反应和存活情况。免疫后1 d、3 d、5d、7 d、9 d、11 d、13 d和15 d采集泄殖腔棉拭子,利用荧光定量RT-PCR方法检测各组排毒情况。同时,免疫一周后采集血液样本,之后每隔3 d采集血液样本并利用间接ELISA检测方法检测血清中抗体水平的变化。结果表明,不同免疫日龄的雏鸭经口服和肌肉注射两种途径接种TMUV弱毒疫苗后未见明显异常反应;雏鸭在5日龄时经口服途径或肌肉注射途径接种TMUV弱毒疫苗可快速的产生高水平抗体。对抗体水平较高的组进行攻毒保护试验,将80羽5日龄樱桃谷雏鸭分为免疫攻毒组、非免疫攻毒组和空白对照组,雏鸭饲养至15日龄时,以1.0 mL/羽的剂量接种病毒液(DTMUV-SDLC),空白对照组注射相同剂量的无菌PBS。攻毒后每天观察雏鸭的临床反应和存活情况。攻毒后7 d、14 d、21 d和28 d,每组随机抽取3羽剖杀,观察比较剖检病理变化。同时,攻毒后3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d、21 d和24 d采集血液样本并利用间接ELISA检测方法检测血清中抗体水平的变化。结果表明,免疫攻毒组与非免疫攻毒组的雏鸭相比未表现出任何临床症状,无死亡,剖检仅见脑部毛细血管有轻微充血,脾脏呈暗红色,其他脏器未见有病理变化;此外,5日龄雏鸭经口服和肌肉注射两种途径免疫TMUV弱毒疫苗后,面对强毒DTMUV-SDLC的攻击具有100%的保护力,取得了良好的免疫保护效果。