番木瓜(Carica papaya L.),俗称木瓜,属番木瓜科(Caricaceae)番木瓜属(Carica L.),为多年生常绿大型草本植物,属呼吸跃变型果实且对低温敏感,不利于运输和贮藏。为了解决这一问题,许多研究者针对番木瓜成熟关键酶基因进行了广泛地研究。近年来,作为最大的植物特异性转录因子NAC在果实衰老过程的调控作用也备受关注。但是鲜见番木瓜NAC转录因子的报道,所以本研究有意探索NAC转录因子在呼吸跃变型果实番木瓜中果实衰老过程的调控机制。研究内容分为三个部分:第一部分为番木瓜果实成熟相关NAC基因的克隆;第二部分主要检测番木瓜NAC基因的组织特异性表达和外源乙烯处理后的表达特征;第三部分为番木瓜NAC基因转化番茄的研究。本研究为进一步深入探讨番木瓜成熟衰老期间转录因子调控机制奠定了试验基础,为耐贮运、长货架期的番木瓜分子育种提供理论依据。本研究主要结果如下:1.从本实验室检测的番木瓜果肉(乙烯/1-MCP处理24h、清水对照)的RNA-seq数据库中初步筛选出可能与番木瓜果实相关的8个NAC候选基因,并利用RT-PCR技术成功克隆基因全长,其N端均含有NAM保守结构域,属于NAC转录因子家族基因,分别命名为CpNAC1-CpNAC8。对其进行了基本理化性质、蛋白结构、基因结构、保守元件、进化树、启动子元件等进行了系统的分析。发现NAC基因在物种间较保守。CpNAC1-CpNAC5蛋白为亲水性不稳定蛋白,CpNAC7和CpNAC8属于疏水性稳定蛋白,CpNAC6属于疏水性不稳定蛋白。8个CpNAC蛋白都不属于分泌蛋白和膜蛋白,各蛋白主要以丝氨酸修饰为主导。亚细胞定位预测知,CpNAC蛋白主要分布在细胞核内。进化树分析表明,8个CpNAC蛋白分属不同的亚家族。2.测定了果实成熟过程中4个时期的果肉硬度、可溶性固形物、主要类胡萝卜素的变化趋势,发现随着果实的成熟,果实硬度呈下降趋势,在破色期急剧下降,果实迅速软化。可溶性固形物的含量呈先上升后下降的趋势,在半黄期含量最高,全黄期有所下降。番茄红素和β-胡萝卜素均呈先上升后稍下降的趋势,隐黄质在果实成熟过程中呈不断上升趋势,在果实成熟的4个时期均未能检测出叶黄素,其中番茄红素含量最高,说明红肉番木瓜的橙红色主要是番茄红素和β-胡萝卜素的积累引起的。3.利用实时荧光定量技术检测番木瓜NAC基因在根、茎、叶、花和四个成熟时期的果实的表达情况,发现CpNAC基因的表达具组织特异性。CpNAC6和CpNAC7在果实成熟过程中,表达量较低且无明显变化,其他6个基因在果实成熟过程中呈不同的趋势,其中,CpNAC1随果实衰老表达量呈逐渐下降的趋势;CpNAC2、CpNAC3随着果实衰老,表达量不断上升;CpNAC4、CpNAC5和CpNAC8在果实成熟过程中,均呈先上升后下降的趋势。另发现同亚族基因的组织特异性相反,这意味着NAC基因家族在长期演化过程中,分化成不同成员,同一家族不同成员在番木瓜生长发育阶段不同组织中各自发挥自己主要作用。4.检测CpNAC基因在外源乙烯处理后的表达特征发现,CpNAC1、CpNAC5在24h时表达量达到最低,显著低于对照;CpNAC2基因与对照没有显著差异;CpNAC3基因在外源乙烯处理后12h时表达量显著升高达到最高值;CpNA00C4、CpNAC8在6h都发生应激反应表达量显著低于对照,且CpNAC8在12h时表达量显著高于对照。由此推测,CpNAC1、CpNAC5可能通过负调控乙烯的生物合成和信号传导参与果实成熟衰老调控过程,CpNAC2、CpNAC4基因可能不是直接通过乙烯信号传导途径来调控果实成熟,CpNAC3、CpNAC8可能受乙烯诱导调控果实成熟。5.利用In-Fusion克隆技术构建了pBI121:CpNAC1、pBI121:CpNAC3和pMDC140:CpNAC5过表达载体,采用农杆菌介导的叶盘法进行番茄的遗传转化,通过PCR鉴定证明CpNAC基因已经导入番茄基因组中,分别获得了过表达CpNAC1番茄T0代阳性苗18株,进一步筛选T1代分离比接近3:1,现获得转CpNAC1番茄T1代阳性苗11株,转CpNAC3番茄T0代阳性苗4株。对转CpNAC1基因的T0代番茄苗进行表型观察发现,转基因果实较野生型番茄果实萼片变黄,成熟期果皮的红色较野生型更浅,偏橙色,果实变小,种子数目明显减少,初步预测CpNAC1基因可能影响胡萝卜素含量,以及种子生长发育。