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分泌型IgA(SIgA)是人体粘膜表面的主要抗体,是抵御病原体侵袭的第一道免疫防线。目前为止尚没有人尝试在动物呼吸道或消化道使用分泌型IgA阻断H5N1病毒的感染。由于禽流感的感染途径主要是呼吸道或消化道,呼吸道或消化道SIgA极有可能在病毒感染的最初阶段产生最好的保护效果。本研究选择在中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary, CHO)细胞中表达具有中和活性的抗H5N1病毒的嵌合SIgA抗体,尝试研发预防性分泌型IgA类抗体。采用本实验室建立的“基因组DNA剪接(Genomic DNA Splicing, GDS)”技术,根据已发表的人IgJ、pIgR和IGHA的核苷酸序列,通过计算机软件分别设计各个基因片段外显子的优化引物,从人外周血基因组DNA中直接扩增各基因的外显子序列;然后人工设计融合相邻外显子的融合引物,采用重叠PCR技术,把各基因片段的外显子串联起来形成全长编码序列,完成基因组DNA的体外剪接,扩增的PCR产物纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector中。序列分析表明,GDS技术扩增的IgJ、pIgR和IGHA基因与GenBank中的目标基因序列完全一致,其中IGHA为IgA2恒定区的序列。从分泌抗禽流感H5N1-HA单抗的杂交瘤细胞HA9中提取总RNA,应用RT-PCR扩增VK和VH基因及信号肽序列,PCR产物克隆到pMD18-T载体上进行序列分析,经分析为小鼠免疫球蛋白基因,重链可变区共有414个碱基,前57个核苷酸编码19个氨基酸前导序列,其VH属于IgHVⅠ家族,D段来自IgHVⅣ家族,J段来自IgHVⅡ家族;轻链可变区共有393个碱基,前60个核苷酸编码20个氨基酸前导序列,V段为IgKVⅢ家族,J段为IgKJⅠ家族。通过融合PCR将鼠源VH基因与人IGHA2基因拼接,VK基因与人CK连接,完成了人/鼠嵌合IgA抗体基因的构建。将人/鼠嵌合IgA抗体重、轻链基因分别克隆到以CMV早期启动子引导,以二氢叶酸还原酶基因(DHFR)和新霉素抗性基因(NEO)为双筛选标记pEF-dhfr-Neo载体中。将IgJ、pIgR基因克隆到以CMV早期启动子引导,以新霉素抗性基因(NEO)为筛选标记pcDNA3.1(+)中。同时通过“质粒快速定带点突变”技术将pcDNA3.1(+)-pIgR中多聚免疫球蛋白受体基因胞内区突变掉,从而完成人分泌成分(secretory component, SC)的真核表达载体构建。用构建的pEF-IGHA9和pEF-IGK9表达质粒转染CHO/dhfr-细胞,经选择培养基(无次黄嘌呤、胸腺嘧啶的DMEM)筛选,挑取阳性克隆用MTX加压进一步提高表达量。对此细胞株扩大培养并纯化抗H5N1病毒的嵌合IgA抗体,用专一性结合人源抗体Kappa链的蛋白L亲和层析柱从含有牛血清的CHO细胞培养上清中纯化重组人源抗H5N1-HA IgA抗体,并进行免疫学特性的分析。同时将构建的pEF-IGHA9、pEF-IGK9、pcDNA3.1(+)-SC和pcDNA3.1(+)-IgJ表达质粒瞬时共转染CHO/dhfr-细胞,培养48-72 h的细胞上清,使用ELISA检测嵌合SIgA抗体各组分的分泌情况。综上所述,本研究成功克隆了人IGHA2、IGJ和pIgR/SC基因以及抗H5N1病毒中和性单抗的V区基因,并对该V区基因序列进行胚系基因片段的分析;获得了完整人-鼠嵌合IgA抗体基因;构建了重组SIgA各相关基因的表达载体;通过转染CHO细胞,初步获得了嵌合IgA和SIgA抗体。