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自然杀伤细胞(NK细胞)是一种效应淋巴细胞,在机体抵抗肿瘤过程中发挥至关重要的作用。由于无需预先致敏,NK细胞即能够直接杀伤肿瘤细胞,并且能够通过分泌细胞因子促进适应性免疫的抗肿瘤作用。基于上述原理,NK细胞在肿瘤免疫治疗中的价值己得到广泛认可。然而,越来越多的研究表明,肿瘤生长过程中,肿瘤细胞可以通过多种机制诱导NK细胞功能紊乱,从而逃避NK细胞的监视。肿瘤发生发展是一个漫长的过程,主要包括起始期、促进期和进展期三个阶段。而在这整个过程中,NK细胞与肿瘤细胞如何相互作用仍不得而知。基于这些,我们展开了本项研究,并取得如下结果:1、NK细胞抑制肺癌起始我们成功构建了Kras突变自发肺癌小鼠模型,根据病理特征,将其发病过程划分为Stage 1、Stage2和Stage 3三个时期,这三个时期分别很好地模拟了肿瘤发生发展的三个阶段,即起始期、促进期和进展期。这一模型为我们研究NK细胞在肺癌发生发展不同阶段的作用提供了便利条件。利用PK136抗体在肺癌发生不同时期清除NK细胞,我们发现,在肿瘤起始期清除NK细胞,Kras小鼠的肺癌更加严重;而在在肿瘤促进期和进展期清除NK细胞,Kras小鼠的肺癌生长情况不受影响。利用NK细胞缺陷鼠,我们发现了相似的现象。这些结果说明,NK细胞能够有效抑制肺癌起始,但是在肺癌促进期和进展期,NK细胞则失去了抗肿瘤能力。2、肺癌进展期NK细胞显著减少我们猜测,在肺癌促进期和进展期,NK细胞丢失抗肿瘤能力可能是由于数量减少以及效应功能下降导致,首先,我们从细胞数量方面进行验证。利用流式细胞术,我们检测了肺癌发生不同阶段肺脏和脾脏的免疫细胞组成,结果表明,随着肺癌不断加重,肺脏的NK细胞、T细胞、B细胞和MDSCs的细胞比例和细胞数量逐渐下降,而巨噬细胞则表现出相反的趋势。值得注意的是,NK细胞减少的最为显著,并且NK细胞急剧减少是从Stage2开始出现的。在此过程中,脾脏多种免疫细胞的组成未见改变。通过免疫荧光原位染色,我们发现肿瘤微环境中的NK细胞主要集中在癌旁部位,很少能够浸润到肿瘤结节内。综上所述,肺癌微环境显著排斥NK细胞,导致其数量和比例明显下降,且肺癌微环境影响NK细胞的关键时间点是Stage 2。3、肺癌微环境中NK细胞效应功能减弱将NK细胞与LLC靶细胞或YAC-1靶细胞共孵育,进行体外杀伤,结果表明Stage 2Kras小鼠和Stage 3 Kras小鼠的肺脏NK细胞杀伤能力明显降低,而脾脏NK细胞的杀伤能力一直较强,不受肺癌发生发展的影响。接下来,我们对与NK细胞脱颗粒、细胞因子分泌和活化相关的分子进行了检测。我们发现,随着肺癌加重,肺脏NK细胞的脱颗粒和细胞因子分泌能力严重受损,并且处于一种低反应性的状态,而脾脏NK细胞的相关分子表达水平不变。上述结果表明,肺癌微环境导致NK细胞效应功能减弱。4、肺癌微环境中NK细胞存活能力受损通过检测Ki67表达水平,胞内ROS染色和体外存活实验多种手段,我们发现肺癌微环境中NK细胞的存活能力显著下降。基因水平上,肺癌微环境中的NK细胞显著富集促进细胞凋亡和负调细胞生长相关基因,进一步印证了此结论。而脾脏NK细胞的存活能力未受影响。综合前面的结果,发生肺癌后,肺脏NK细胞的效应功能减弱,存活能力受损,这些表明肺癌微环境中的NK细胞处于功能紊乱状态。5、肺癌微环境中NK细胞的FBP1表达增加,同时糖酵解代谢下降葡萄糖代谢对于人和小鼠NK细胞行使功能非常重要,葡萄糖代谢异常可能会直接影响NK细胞的生存和活化,因此,我们想了解肺癌微环境中NK细胞功能紊乱是否与葡萄糖代谢有关。基因芯片结果揭示肺癌微环境中NK细胞高表达葡萄糖代谢相关基因Fbp1(编码果糖-1,6-二磷酸酶),免疫荧光、免疫印迹和PCR检测进一步确认了此现象。机制方面,肺癌发生后,肿瘤微环境累积大量TGF-β,进而促进NK细胞上调表达FBP1。此外,通过检测细胞外酸化率(ECAR),我们发现,肿瘤微环境中的NK细胞糖酵解代谢显著下降。6、抑制FBP1能恢复NK细胞功能我们想知道上调的FBP1和下降的糖酵解是否与NK细胞功能紊乱有关,所以使用了 FBP1抑制剂MB05032和糖酵解抑制剂2DG进行体外抑制实验。结果表明,加入MB05032后,Stage 2 Kas小鼠肺脏NK细胞的糖酵解、效应功能和存活能力均有一定程度的增强,这说明NK细胞高表达的FBP1会抑制自身糖酵解代谢、效应功能和存活能力。但是使用MB05032处理并不能改善Stage 3Kras小鼠肺脏NK细胞的状态。进一步,我们发现抑制了糖酵解的同时,再抑制FBP1,则不能提高Stage 2 Kas小鼠肺脏NK细胞的杀伤能力,但是仍然能够提高Stage 2 Kas小鼠肺脏NK细胞的存活能力,这表明,FBP1通过抑制细胞糖酵解,进而削弱了 NK细胞的杀伤能力;但是FBP1能够直接损害NK细胞的存活能力,这个过程不依赖于糖酵解。综上所述,利用Kras突变肺癌小鼠模型,我们证明,在肿瘤起始期,NK细胞有强大的抗肿瘤功能,但是在肿瘤促进期和进展期,NK细胞丧失了抗肿瘤能力。进一步研究发现,NK细胞丢失抗肿瘤能力与其自身功能紊乱密切相关。在机制方面,肺癌发生后,肿瘤微环境累积大量TGF-β,进而促进NK细胞上调表达FBP1,异常表达的FBP1抑制细胞自身糖酵解代谢,同时破坏细胞存活能力,最终导致NK细胞功能紊乱。值得注意的是,抑制NK细胞的FBP1活性能够恢复NK细胞功能。总之,本研究展示了肿瘤发生发展过程中NK细胞的动态改变,揭示了一种NK细胞功能紊乱的新机制,这些发现对于优化NK细胞的肿瘤免疫治疗有重要指导意义。