糖尿病(Diabetes)是一种以慢性高血糖为特征的代谢性疾病,按其病因不同可分为三类:因自身免疫导致的Ⅰ型糖尿病、以胰岛素抵抗为主要特征的Ⅱ型糖尿病以及妊娠诱发的妊娠期糖尿病,其中Ⅱ型糖尿病约占糖尿病总体人群的90%以上。肥胖是导致Ⅱ型糖尿病的主要因素之一,在其病程发展过程中,脂肪细胞数目及体积异常增加,且脂肪细胞通过分泌功能性脂肪细胞因子,调控机体胰岛素敏感性,代谢相关炎症亦为肥胖导致的Ⅱ型糖尿病的主要病理特征。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)是核激素受体超家族的一员,是配体依赖型的核转录因子。PPARγ的功能涉及到调节糖脂代谢、调节免疫反应、促进细胞分化等多方面。PPARγ功能异常与多种疾病密切相关,如糖尿病、动脉粥样硬化和肿瘤等,因此PPARγ为治疗代谢相关疾病的重要药物靶点。在PPARγ转录及功能调控中,PPARγ翻译后修饰是关键步骤,而翻译后磷酸化修饰对于PPARγ转录活性与转录模式的影响尤为突出。本实验室前期药物筛选工作发现,几种活性分子对PPARγ具有配体非依赖性的调控作用,可在不与PPARγ结合的情况下,改变PPARγ表达谱、提高胰岛素敏感性,并遏制代谢炎症反应。我们对这几种分子调控PPARγ翻译后修饰的模式进行了全面分析,发现几种对PPARγ活性影响较大的分子,既不能影响PPARγ的苏素化、亚硝基化等修饰,也不能启动PPARγ Ser1 12和Ser273两个已知磷酸化位点的修饰。据此,我们推测:在PPARγ功能体现过程中,可能存在其它的修饰位点。因此,我们设计:首先从发现PPARγ新磷酸化修饰位点出发,探讨PPARy的新功能与作用特点。本论文研究内容即是根据此思路而设计,在此,本研究探讨了 PPARγ-Ser186磷酸化修饰新模式及其在Ⅱ型糖尿病进展中的功能与机制。工作从PPARγ-Ser186磷酸化调控胰岛素敏感性与代谢相关炎症两方面展开,主要研究内容与结果如下:一.PPARγ磷酸化修饰新模式的鉴定与分析1.生物信息学分析:根据SCANSITE软件分析、评分筛选数据,我们得到了三个可能的磷酸化位点。验证实验运用相关突变质粒构建及荧光素酶报告基因筛选的方法,发现PPARγ Ser186位点发生磷酸化修饰可显著调控PPARγ转录活性。2.上游激酶鉴定:SCANSITE软件分析、评分筛选结果显示,对PPARγ Ser186位点进行磷酸化修饰的可能激酶为PKCα和PKA。为验证该结果,实验进一步构建了 PKCα和PKA质粒,利用荧光素酶报告基因系统、免疫共沉淀、Western Blot分析进行检测,结果显示:PKCα可显著提高PPARγ Ser186位点的磷酸化水平,并且对其活性有明显调控作用,同时PKCα与PPARγ之间存在明显的相互作用,说明PKCα就是Ser186位点的上游激酶。而PKA对于PPARγ-Ser186磷酸化及其活性调控都不发挥作用。3.激酶活性分析:Western Blot检测结果显示,PKCα不仅可以启动PPARγ-Ser186的磷酸化,而且可部分提高PPARγ-Ser112的磷酸化水平,但对PPARγ-Ser273磷酸化无影响。说明PKCα可同时影响Ser186与Ser112位点的磷酸化修饰,但以启动Ser1 86位点修饰为主。而PKA对于Ser1 12和Ser273的磷酸化均无显著影响。二.PPARγ-Ser186磷酸化修饰对胰岛素敏感性的影响1.PPARγ-Ser186磷酸化修饰的细胞实验分析:构建3T3-L1脂肪细胞分化模型,qPCR和ELISA检测结果显示:PPARγ Ser186位点的磷酸化可降低脂肪细胞因子Adiponectin和Adipsin的分泌。Chip实验证实:PPARγ Ser186位点的磷酸化可改变PPARγ与Adiponectin启动子区域的结合,从而降低Adiponectin的表达。CRISPR/Cas9干扰实验进一步证明PKCα可通过磷酸化PPARγ-Ser186影响Adiponectin的表达。另外,油红染色结果表明PPARγ-Ser186磷酸化修饰后,脂肪细胞的分化未受到显著影响。2.PPARγ-Ser186磷酸化修饰的体内分析:以Ⅱ型糖尿病ob/ob小鼠为实验动物模型,运用Western Blot方法检测脂肪细胞中PPARγ-Ser186的磷酸化,结果表明:ob/ob小鼠PPARγ Ser186位点的磷酸化水平较野生型小鼠显著升高。同时,以C57BL/6J小鼠的Fasting模型为饥饿模型,Western Blot分析结果表明:Fasting小鼠脂肪细胞中PPARγ-Ser186的磷酸化较野生型小鼠显著降低。以上结果提示:PPARγ-Ser186磷酸化与胰岛素抵抗存在密切相关性。3.胰岛素敏感性分析:以ob/ob小鼠为实验动物模型,PKCα抑制剂(Ro)处理动物后进行Western Blot、葡萄糖耐量、胰岛素耐量和血清学指标(血糖、甘油三酯、胆固醇等)检测,以观察抑制上游激酶活性对ob/ob小鼠PPARγ-Ser186磷酸化水平和Ⅱ型糖尿病症状的影响。结果表明:Ro处理后可显著抑制PPARy-Ser186磷酸化,提高ob/ob小鼠的胰岛素敏感性,从而改善高血糖、高血脂等Ⅱ型糖尿病症状。结合本实验室前期实验对二甲双胍(Met)激活PPARγ的特性分析结果,在本研究工作结果基础之上,进一步分析了 Met对PPARγ的调控方式,Western Blot、qPCR和ELISA实验皆表明:Met可以降低PKCα活性从而抑制PPARγ-Ser186磷酸化,提高下游胰岛素敏感性基因Adiponectin的表达,最终改善机体的胰岛素抵抗状态,在此发现Met提高胰岛素敏感性的一条新途径。三.PPARγ-Ser186磷酸化对代谢相关炎症的影响1.体内实验分析:ob/ob小鼠为实验动物模型,Met和Ro处理后进行HE染色和qPCR检测,发现脂肪组织内炎性细胞(主要为单核-巨噬细胞)的浸润明显减少;脂肪组织巨噬细胞(AdiposeTissueMacrophages,ATMs)从促炎的M1型转换为抑炎的M2型。说明Met和Ro可通过调控代谢相关炎症中的中枢免疫细胞—巨噬细胞的极化与功能,而有效抑制代谢相关炎症。2.细胞实验分析:以RAW264.7巨噬细胞株为模型,通过Western Blot分析证实巨噬细胞内也存在PPARγ-Ser186的磷酸化现象。qPCR、流式细胞分析及ELISA实验进一步验证了该磷酸化修饰介导巨噬细胞向M1型极化,而Met和Ro可通过降低PPARγ-Ser186的磷酸化,将巨噬细胞转变为M2型,使代谢相关炎症得以遏制。以上结果提示:PPARγ-Ser186磷酸化与代谢相关炎症存在密切联系。本论文研究工作创新点体现在:1.发现了一种PPARγ磷酸化修饰的全新模式,并在此基础上探讨了 PPARγ这种翻译后修饰方式的生理学与病理学意义;2.发现PPARγ-Ser186磷酸化修饰改变了 PPARγ对脂肪因子分泌的调控,从而降低了机体对胰岛素的敏感性,这一过程可通过Met和Ro进行逆转;3.发现PPARγ-Ser1 86磷酸化介导巨噬细胞极化与活化方式的转型,从而促进代谢相关炎症的发展,该过程也可被Met和Ro逆转;4.提出Met发挥调控细胞代谢药学效应的一条新途径。由此可见,PKCα/PPARγ这一PPARγ功能调控节点在Ⅱ型糖尿病导致的代谢紊乱中占据重要调控地位,本研究得到的相关结果,不仅提出了一种PPARγ发挥生物学功能的新概念,而且在此基础之上,可通过进一步深入工作,发展基于PKCα/PPARγ分子节点的靶向治疗与药物研发。