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CRISPR/Cas9基因编辑技术自2013年问世以来,被广泛应用在多种动植物的基因敲除或敲入研究中,改良的CRISPR/Cas9 RNP(ribonucleoproteins)技术是一种无外源DNA的基因编辑技术,使用该方法获得的编辑植株最终无外源DNA的整合,成功避免了后代分离的复杂步骤,且更利于公众的接受;其还具有较低脱靶率的优势,因此在农作物的遗传改良应用中极具发展潜力。日本结缕草(Zoysia japonica Stued.)是我国极其宝贵的草种资源,拥有众多优良特性,但在北方绿期短的特点成为其大面积推广使用的主要限制因子,该试验拟通过构建CRISPR/Cas9 RNP编辑体系与结缕草遗传转化体系,改良结缕草持绿性状,为创制绿期延长性状的结缕草育种材料做尝试性研究,试验得到以下主要结果:1、进一步优化了结缕草成熟种子愈伤组织诱导方法。6-BA对结缕草种子发芽率及诱导率有抑制作用;α-酮戊二酸显著提高了发芽率与诱导率,且在0-1OOmg/L的范围内随着浓度的增加而升高;正交试验表明试验范围内1号培养基组合是使发芽率与诱导率最高的组合:即在MS培养基种添加1mg/L2,4-D、0.1mg/L6-BA、50mg/L α-酮戊二酸、2mg/LVB1与2.5mg/LCuSO4,使发芽率与诱导率分别达到86.67%与81.33%;且表明对发芽率影响作用的顺序为α-酮戊二酸>2,4-D>VB1>6-BA;对诱导率影响作用的顺序为2,4-D>a-酮戊二酸>VB1>6-BA;通过不同品种的比较试验得出“Compadre”品种的诱导率明显高于“Zenith”与“Chinese Common”,但“Zenith”状态较优。通过继代培养得到了大量的胚性愈伤组织,并可用于下一步试验。2、结缕草再生体系的研究结果表明,分化生芽的过程中会有异常分化情况的发生,具体表现为只有根状物长出而无芽原基形成。结果显示,0.2mg/L的6-BA对愈伤组织分化生根具有明显的促进作用。3、结缕草ZjSGR CRISPR/Cas9 RNP基因编辑体系各元件的构建和制备。以pHUN411gRNA-1、2、3为模板,根据ZjSGR基因设计特异性引物,反转录获得100ng/uL的三个sgRNA体外转录模板,通过T7体外转录并纯化最终获得三个靶位点的sgRNA浓度分别为3.4μg/μL、3.0μg/μL及3.8μg/μL,达到转化目标要求;将Cas9基因构建在原核表达载体pET-28a上,获得重组载体pET28a-cas9-His并通过大肠杆菌菌株BL21表达,纯化后获得Cas9蛋白终浓度为1μg/μL,Cas9蛋白的分子量约为200KDa。高质量sgRNA与Cas9蛋白的获得为成功建立起RNP编辑体系奠定基础。4、将sgRNA与Cas9蛋白在体外于Cas9蛋白反应缓冲液中预混,通过基因枪法将RNP导入结缕草“Chinese Common”品种胚性愈伤组织。由于此体系无选择标记基因可供大量筛选,因此验证ZjSGR基因的编辑效率工作量较大,该结果还需要进一步的研究。