双重抗肺纤维化基因嵌合重组体蛋白的研制

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目的:中性粒细胞抑制因子(NIF)是整合素β2的专一性拮抗剂,能抑制中性粒细胞与内皮细胞的粘附和聚集,阻止白细胞的渗透和浸润。角质细胞生长因子(KGF)是成纤维细胞生长因子家族中的一员,由间充质细胞分泌并特异性地作用于上皮细胞促进其生长繁殖。许多实验均证明KGF和NIF在肺脏的发育、炎症和修复中发挥重要的作用。针对NIF能够抑制病理性自身免疫反应和KGF能够修复损伤的肺泡上皮及抑制纤维化的功效,我们构建了这两种细胞因子的基因嵌合重组体,并进行表达,目的是研制能够治疗急性肺损伤和肺纤维化的重组蛋白,为进一步的研究和开发奠定基础。方法:以8个甘氨酸作为铰链区,运用over-lap PCR的方法将NIF与KGF连接,获得双重抗肺纤维化基因嵌合重组体NKM的基因序列。利用pET原核表达系统,在BL21 Star (DE3)plysS大肠杆菌中高效表达NKM。经过测序、诱导表达、纯化和Western-Blot等确证后,再对NKM的体内外活性进行测定。结果:本研究成功构建了双重抗肺纤维化基因重组嵌合体NKM;并在BL21 Star (DE3)plysS大肠杆菌中表达量达到25%;经Western-Blot检测有免疫活性;通过DEAE层析柱纯化得到纯度为80%的NKM;体外细胞活性测定表明,NKM对白细胞粘附有剂量依赖性的抑制作用,对成纤维细胞生长也有剂量依赖性的抑制作用;动物体内活性测定显示,NKM抑制急性肺损伤后循环内白细胞的增加;病理解剖显示NKM能明显抑制博莱霉素诱导的肺炎和肺纤维化。结论:本实验获得了具有双重功能的抗肺纤维化嵌合体蛋白,可用于治疗急性肺损伤和肺纤维化,并有望用于治疗其它与白细胞活化浸润及组织纤维化有关的多种临床疾病。
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