论文部分内容阅读
目的:探讨利用兔骨髓间充质干细胞(MSC)在支架材料骨基质明胶(BMG)上体外培养构建骨软骨复合物的可能性。方法:实验于2008.06-2009.01在大连医科大学附属二院实验中心完成。①2-3月龄日本大耳兔,体重2.5-3.5kg,雌雄不限,无菌条件下骨髓穿刺针取股骨骨髓,采用密度梯度离心法和贴壁筛选法分离纯化骨髓间充质干细胞,传代倍增后,取第3.4代生长状态良好的间充质干细胞,在特定的软骨诱导剂(HG-DMEM中加入地塞米松、维生素C、TGF-β1、ITS-3146)和成骨诱导剂(15%FBS+LG-DMEM中加入地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠)下定向诱导骨髓间充质干细胞。②制备一侧全脱钙,一侧未脱钙的“双相”BMG支架载体。③将诱导后具有成骨细胞和软骨细胞相应表型的MSC分别移植到事先处理好的“双相”支架载体上继续培养,分别在1w,3w行Masson染色、碱性磷酸酶(ALP)染色,Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色。结果:①倒置相差显微镜观察MSC原代细胞生长缓慢,呈短梭形,1-3w可达70-80%融合,传代细胞48h内增殖缓慢,3d后细胞增殖旺盛,7-8d进入平台期,第3.4代增殖最为旺盛,成骨诱导后细胞形态由长梭型变为多边形,立方形,三角形。软骨诱导后的MSC细胞呈椭圆形或圆形。②制备的同种异体骨基质明胶(BMG)为三维多孔海绵状结构,可塑性好,有弹性,并有适宜的强度,未脱钙的一侧强度较高,脱钙的一侧强度较对侧低。③Masson染色:培养21d,可见成骨诱导侧显示蓝色表达,软骨诱导侧现实红色表达。ALP染色:培养7d,ALP染色不明显,未形成钙结节,培养21d可见成骨细胞胞浆内出现大量棕黑色颗粒,对照组未见着色。Ⅱ型胶原免疫组化染色:培养21d后见切片软骨细胞侧胞浆内棕黄色表达,Ⅱ型胶原免疫组化染色为阳性。结论:一侧全脱钙,一侧未脱钙的异体BMG可做为组织工程支架材料,可以结合自体MSC诱导的成骨和软骨前体细胞在体外制备组织工程骨软骨复合物,为以后利用组织工程技术修复关节软骨缺损提供了可能性。