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第一部分不同浓度地塞米松对机械损伤脊髓神经元自噬与凋亡的影响目的:探讨不同浓度地塞米松对机械损伤脊髓神经元自噬与凋亡的影响。方法:(1)原代培养胎鼠脊髓神经元,NSE和TUBB3、DAPI免疫荧光双标鉴定脊髓神经元;(2)实验分组(正常组、损伤对照组、Dex10-7M、Dex10-6M、Dex10-5M)建立神经元机械损伤模型并于损伤后立即给予不同干预因素处理24h;(3)MTT法观察各组脊髓神经元的活性;(4)Western Blotting检测自噬相关蛋白(LC3及Beclin-1)及凋亡蛋白(Caspase-3)表达水平;(5)QPCR检测自噬相关基因m RNA(LC3Ⅱ及Beclin-1)及凋亡基因m RNA(Caspase-3)水平;(6)流式细胞仪检测各组脊髓神经元凋亡率;(7)AO荧光染色检测各组脊髓神经元自噬表达情况;(8)透射电镜检测各组脊髓神经元自噬及凋亡情况。结果:⑴脊髓神经元生长状态良好;脊髓神经元鉴定:NSE、TUBB3、DAPI三者均阳性所占比例高;⑵MTT:损伤各组与正常组相比细胞活力明显下降,10-7M激素组细胞活力较损伤对照组有所增高,但无统计学差异(P>0.05);10-6M激素组细胞活力较损伤对照组明显增高,而10-5M激素组细胞的活力却明显下降(P<0.05);⑶Western Blotting:正常组LC3Ⅱ与Beclin1明显低于损伤各组;随地塞米松浓度的增高LC3Ⅱ逐渐降低(P<0.05);正常组的Caspase-3表达水平明显低于损伤各组,10-5、10-6M激素组的Caspase-3表达水平明显低于损伤对照组(P<0.05),10-6M激素组Caspase-3表达水平最低,10-5M激素组较10-6M激素组Caspase-3表达水平有所升高但无明显差异(P>0.05);⑷QPCR:正常组LC3Ⅱ与Beclin1的m RNA水平明显低于损伤各组,随地塞米松浓度的增高自噬水平逐渐降低呈浓度依赖性(P<0.05);10-5、10-6M激素组Caspase-3的m RNA水平明显低于损伤对照组(P<0.05),10-6M激素组Caspase-3的m RNA水平最低,10-5M激素组较10-6M激素组Caspase-3 m RNA水平升高但无明显差异(P>0.05);⑸流式细胞术:损伤各组凋亡水平明显高于正常组,10-5、10-6M激素组的凋亡水平明显低于损伤对照组(P<0.05),10-6M激素组凋亡水平最低,10-5M激素组较10-6M激素组凋亡水平升高但无明显差异(P>0.05);⑹AO:正常组的细胞内红绿荧光强度比明显低于损伤各组;随激素浓度增高红绿荧光强度比呈递减趋势;⑺透射电镜:正常组细胞内很少看到自噬体及凋亡小体,损伤各组皆可观察到明显的双层膜自噬体及凋亡小体结构;随着激素浓度的增高,自噬体、凋亡小体数量呈减少趋势;10-5M激素组凋亡小体较10-6M激素组有所增多。结论:⑴机械损伤后,脊髓神经元自噬及凋亡水平呈不同程度上升;⑵地塞米松抑制受损神经细胞自噬,自噬水平与激素呈浓度依赖性,随着激素浓度增高抑制作用也趋明显;⑶大剂量地塞米松保护受损脊髓神经元通过抑制脊髓神经元凋亡;然而激素浓度过高,减弱对细胞的保护作用;低浓度激素对细胞的保护作用不明显;⑷大剂量地塞米松减少受损脊髓神经元凋亡可能是通过抑制脊髓神经元自噬性细胞死亡。第二部分调控自噬对地塞米松干预急性损伤脊髓神经元自噬与凋亡的影响目的:调控自噬对地塞米松干预机械损伤脊髓神经元自噬与凋亡的影响。方法:(1)实验分组(Dex10-6M、Dex10-6M+Rap、Dex10-6M+3-MA),并分别采用雷帕霉素(Rap)和3-甲基腺嘌呤(3-MA)促进、抑制细胞自噬活性干预24h;(2)Western Blotting检测自噬相关(LC3及Beclin-1)及凋亡相关(Caspase-3)蛋白表达水平;(3)QPCR检测自噬相关(LC3Ⅱ及Beclin-1)及凋亡相关(Caspase-3)m RNA水平;(4)流式细胞仪检测干预后对各组脊髓神经元凋亡的影响;(5)AO荧光染色检测各组脊髓神经元自噬强弱;(6)透射电镜检测各组脊髓神经元自噬及凋亡情况。结果:⑴Western Blotting:与对照组相比,3-MA组LC3Ⅱ表达水平明显降低,Rap组LC3Ⅱ明显增高(P<0.05);3-MA组的Caspase-3表达水平明显低于其他两组,Rap组Caspase-3表达水平增高(P<0.05);⑵QPCR:与对照组相比,3-MA组LC3Ⅱm RNA水平下降明显,Rap组LC3Ⅱm RNA水平明显增高(P<0.05);3-MA组的Caspase-3m RNA表达水平明显低于其他两组,Rap组Caspase-3m RNA表达水平最高(P<0.05);⑶流式细胞术:3-MA组脊髓神经元凋亡率明显低于其他两组,Rap组的细胞凋亡率最高(P<0.05);⑷AO:3-MA组的细胞内红绿荧光强度比明显低于其他两组;Rap组红绿荧光强度比最强;⑸透射电镜:3-MA组细胞内自噬体及凋亡小体明显低于其他两组,Rap组可观察到明显的双层膜自噬体及凋亡小体结构。结论:受损脊髓神经元自噬水平抑制后,细胞凋亡明显减少;诱导激活受损脊髓神经元自噬后,细胞凋亡水平明显增高,由此猜测:大剂量激素保护受损脊髓神经元可能是通过抑制自噬减少自噬性细胞死亡,其机制可能与m TOR信号通路有关。