肿瘤是威胁宠物生命健康的最主要病因之一,而宠物自发肿瘤与人类肿瘤发生、发展的机制相对保守,所以参照人类肿瘤的研究方法,开发宠物肿瘤治疗方法是非常必要的。以PD-1/PD-L1阻断为代表的免疫检查点阻断疗法已在临床肿瘤治疗中取得了喜人的进展,但也存在患者响应率低的应用局限。这可能与肿瘤所处的免疫抑制微环境有关。所以靶向肿瘤微环境（Tumor Microenvironment,简称TME）,可能是突破免疫检查点阻断疗法应用局限的一种有效手段。卡介苗（Bacille Calmette-Guerin,简称BCG）和细胞焦亡,均已被证明可在肿瘤部位激起强烈的抗肿瘤免疫反应,是很好的重塑TME免疫状态的工具。目前BCG仅在临床非肌层浸润性膀胱癌的治疗中得到应用,而在其他肿瘤类型,例如三阴性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer,简称TNBC）中的应用和研究相对较少。此外,诱发焦亡的gasdermin蛋白家族N端结构域(the N-terminal gasdermin domain,GSDMNT)具有很强的细胞毒性,常规的基因递送载体包装策略无法避免包装时GSDMNT的表达,因此很难获得携带GSDMNT的重组载体,所以目前缺乏将GSDMNT安全有效递送至肿瘤细胞的方法。本研究以BCG及焦亡为手段,构建了利用BCG或焦亡激活TME内抗肿瘤免疫的溶瘤策略,研究了BCG或焦亡对动物肿瘤模型的溶瘤机制,探索了PD-L1阻断剂与BCG或焦亡联合使用对TNBC小鼠模型的疗效,并进一步在宠物肿瘤临床治疗应用中进行了初步探索。本研究主要取得了以下结果:1利用卡介苗靶向肿瘤微环境增强抗肿瘤免疫1)在TNBC小鼠模型中证实,单倍剂量BCG治疗能够上调肿瘤中趋化因子相关基因和抗肿瘤效应基因的表达,下调免疫抑制相关基因的表达,增加肿瘤浸润淋巴细胞数量,重塑TME免疫抑制状态;三倍剂量BCG治疗可以显著抑制肿瘤生长,但也存在小鼠体重下降的不良反应。2)利用Bulk RNA-seq和q RT-PCR证实,单倍剂量BCG治疗可以上调TNBC小鼠模型肿瘤中免疫筛查位点PD-1和PD-L1的表达;在此基础上开发了单倍剂量BCG联合PD-L1抑制剂的溶瘤方案,并在TNBC小鼠模型中证实该联合治疗方案具有显著溶瘤效果且没有体重下降的不良反应。2构建表达焦亡蛋白的重组腺相关病毒载体以增强抗肿瘤免疫1)筛选出一个在昆虫Sf9细胞中不表达的哺乳动物启动子m CBA,证实了以m CBA启动子驱动GSDMNT可以避免昆虫Sf9细胞的焦亡;由此开发了利用哺乳动物启动子m CBA和杆状病毒/昆虫Sf9细胞包装表达焦亡蛋白重组腺相关病毒载体的策略,并获得了可以介导肿瘤细胞焦亡的溶瘤腺相关病毒载体P1（Oncolytic AAV P1,简称o AAV-P1）。2)证实将GSDMNT基因序列翻转并在两侧加上两对反向lox P序列可避免HEK293T细胞的焦亡,加入Cre重组酶则又可恢复GSDMNT的表达从而介导焦亡,由此开发了利用Cre重组酶和三质粒/HEK 293T细胞包装表达焦亡蛋白重组腺相关病毒载体的策略,并获得了可以介导肿瘤细胞焦亡的溶瘤腺相关病毒载体P2（Oncolytic AAV P2,简称o AAV-P2）。3)在肿瘤细胞及多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiforme,简称GBM）大鼠模型中证实了o AAV-P2相对o AAV-P1有更好、更快的溶瘤效果,并证实此种差异与昆虫Sf9细胞包装的AAV感染性弱及m CBA启动子活性相对弱均有关。4)在GBM大鼠模型中证实,o AAV-P2介导的焦亡可以暂时性打开血脑屏障,破坏GBM的TME,招募淋巴细胞杀伤肿瘤,延长GBM大鼠模型的生存期;在TNBC小鼠模型中证实,o AAV-P2治疗可以上调肿瘤中趋化因子相关基因和抗肿瘤效应基因的表达,下调免疫抑制相关基因的表达,增加肿瘤内淋巴细胞浸润,改变TME免疫抑制状态。5)通过对TNBC小鼠模型肿瘤Bulk RNA-seq分析,发现o AAV-P2治疗可以增加肿瘤内免疫筛查位点PD-L1和PD-L2的表达,由此开发了o AAV-P2联合PD-L1阻断剂的溶瘤方案,并在TNBC小鼠模型进行了验证,证实了该联合方案具有很好的肿瘤治疗效果,可显著抑制TNBC小鼠模型肿瘤生长。本研究以TME为靶点,开发了BCG联合PD-L1阻断剂的溶瘤方案,该方案可有效治疗TNBC,为宠物临床发病率较高的乳腺癌提供了有效治疗方案;同时本研究构建了两种表达焦亡蛋白重组腺相关病毒的包装策略,获得了具有溶瘤效果的o AAV-P1和o AAV-P2;且这两种包装策略具有良好的扩展性和安全性,也可用于其他毒性蛋白的重组腺相关病毒载体的包装,为靶向TME的宠物肿瘤治疗提供了更多的备选工具。