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目的恶性外周神经鞘瘤（Malignant peripheral nerve sheath tumor,MPNST）,起源于施万细胞或施万细胞前体细胞,是一类具有高度恶性、发展迅速、易转移复发且预后较差的侵袭性软组织肉瘤,约占所有软组织肉瘤的5-10%。大多数先前经典的遗传学研究都集中在NF1、TP53、CDKN2A和p16INK4A等基因上,然而最近一些研究人员对MPNST进行测序发现,在MPNST中PRC2核心组分SUZ12和EED的突变失活也属于频发事件。SUZ12是编码Zeste同源蛋白12的基因,是PRC2的重要核心成分,可以通过稳定PRC2复合体保证H3K27me3在表观遗传修饰过程中功能的正常发挥。为了进一步探索SUZ12在MPNST中的具体作用,我们使用慢病毒载体系统构建SUZ12基因过表达及敲除的MPNST稳定细胞株,通过细胞表型、免疫组化等相关实验来初步探讨SUZ12对MPNST的影响,为进一步进行机制研究和体内实验奠定基础。方法RT-qPCR的方法检测SUZ12在两种MPNST细胞系中m RNA的表达丰度,确定过表达组和敲减组。通过PCR方法合成SUZ12基因全长,设计合成特异性sg RNA干扰靶序列,构建重组表达质粒,用酶切和测序的方法进行验证。重组质粒转染293T细胞包装慢病毒,荧光法测定效价。确定慢病毒感染的最佳MOI值和嘌呤霉素筛选剂量,转染ST88-14和STS26T细胞以构建过表达和敲除的MPNST稳定细胞系。荧光显微镜观察稳定转染细胞株中绿色荧光蛋白的表达,RT-qPCR和Western blotting验证过表达组的效果,测序、突变试剂盒和Western blotting验证敲除组的效果。之后我们通过CCK8和克隆形成实验测定SUZ12是否影响MPNST的增殖能力,划痕实验和Transwell实验测定SUZ12是否影响MPNST的侵袭和迁移能力。Western blotting验证SUZ12的表达水平与H3K27me3的表达水平的相关性。IHC分析MPNST患者的临床标本中SUZ12和H3K27me3的表达情况及预后关系。结果1.RT-qPCR结果显示,STS26T细胞中SUZ12 m RNA的表达水平为ST88-14细胞中的2.5倍,故我们在ST88-14细胞中进行SUZ12过表达,在STS26T细胞中进行SUZ12敲除。酶切和测序的结果显示过表达和敲除的质粒载体构建成功。MOI=100和MOI=10分别为过表达慢病毒和CRISPR/Cas9慢病毒的最佳MOI值,嘌呤霉素筛选的最佳剂量为2μg/m L。通过荧光显微镜观察稳定转染细胞株中绿色荧光蛋白稳定表达,RT-qPCR和Western blotting的结果显示LV-SUZ12中SUZ12 m RNA和蛋白含量明显高于对照组。STS26T-Cas9稳定细胞株转染sg RNA后,通过PCR产物测序表明sg RNA-1和sg RNA-2序列中不存在SNP位点,可以用于后续实验;突变试剂盒检测结果显示与阴性对照组相比,sg RNA-1组中出现了预期大小的条带,即在靶位点成功引入了突变;故使用sg RNA-1进行后续试验。Western blotting结果也显示sg-SUZ12组中SUZ12的蛋白含量明显低于对照组细胞。2.CCK8实验显示SUZ12过表达后细胞生长在第五天时比对照细胞显著减少,克隆形成实验表明SUZ12过表达后细胞与对照组细胞相比形成了更小和更少的集落;划痕实验和Transwell迁移实验中SUZ12过表达显著降低了MPNST细胞的迁移能力,Transwell侵袭实验中SUZ12过表达显著降低了MPNST细胞的侵袭能力,但是在SUZ12敲除组中细胞增殖、侵袭和迁移能力并没有统计学差异。Western blotting结果表明SUZ12过表达后LV-SUZ12组中H3K27me3的表达水平显著提高,而SUZ12敲除组中无显著性差异。IHC结果显示90.5%（38/42）的组织样本显示SUZ12表达完全缺失,9.5%（4/42）为弱阳性,SUZ12在所有MPNST标本中处于低表达状态。73.8%（31/42）的H3K27me3在MPNST中表现出不同程度的缺失,且H3K27me3低表达组（阴性+弱阳性）相对于高表达组（中等阳性+强阳性）总体生存时间明显较差（OS,P=0.042）,但无病生存期没有明显差异（DFS,P=0.106）。结论1.我们利用慢病毒载体系统成功构建了SUZ12过表达及敲除的重组慢病毒载体,并建立了稳定表达SUZ12的ST88-14稳定细胞株和SUZ12敲除的STS26T稳定细胞株。2.SUZ12在部分MPNST中,过表达降低MPNST的增殖、侵袭和迁移能力,增加H3K27me3的表达水平。3.H3K27me3不仅可以作为MPNST的诊断标记物,其表达状态也可为疾病预后提供参考。