苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali)引起的苹果树腐烂病是目前在中国乃至东亚苹果生产上最具破坏性的真菌病害之一。小分子RNA介导的RNA沉默途径在调节生物体的生长发育及多种生命过程中发挥着重要的作用,而这个途径需要Dicer蛋白和Argonaute蛋白的参与。在动植物和一些真菌中,小RNA通路相关基因的功能研究已有报道,但这些基因的功能在苹果树腐烂病菌中尚不清楚。本文通过对小RNA生成通路中的两类关键基因家族dicer-like(DCL)和Argonaute(AGO)进行基因敲除,比较基因敲除突变体与野生型之间的生长表型和致病力差异,探讨DCL和AGO的基因功能,为揭示苹果树腐烂病菌小RNA生成的分子遗传机制奠定基础。本实验研究结果如下:1.通过生物信息学分析,发现苹果树腐烂病菌中存在2种Dicer-like和3种Argonaute。2.根据同源重组原理构建了 VMDCL1、VMDCL2、VMAGO2和VMAGO3四个基因的敲除载体,通过PEG介导的原生质体转化苹果树腐烂病菌,经过PCR和Southern杂交验证分别得到了 4个VMDCL1敲除突变体,5个VMDCL2敲除突变体,1个VMAGO3敲除突变体以及6个VMAG02敲除突变体。3.DCL2基因可能与菌丝的营养生长有关,与野生型相比DCL2敲除突变体的菌丝体产量明显增多;DCL1可能与苹果树腐烂病菌的致病力相关,对苹果富士叶片的侵染结果表明,敲除DCL1后其致病力明显增强,而DCL2基因的缺失对苹果树腐烂病菌的致病力并无明显的影响。4.AGO2基因可能与菌丝的生长发育相关,敲除AGO2后菌丝变粗并且分枝减少;AGO3基因可能与繁殖体的形成有关,与野生型03-8相比,AGO3的敲除突变体繁殖体数量明显增多;AGO2和AGO3基因可能与致病力相关,敲除AGO2基因后其致病力明显减弱,而AGO3基因的敲除突变体致病力明显增强。5.DCL1、DCL2和AGO2可能参与外界胁迫反应的应答。在过氧化氢胁迫实验中,与野生型03-8相比,DCL1缺失突变体对过氧化氢的耐受性增强,DCL2缺失突变体变得敏感,AGO2的缺失导致其在过氧化氢胁迫下生长明显畸形;在不同渗透压力实验中,DCL1的缺失突变体在高渗透压力条件下变得更加敏感,几乎不生长,而其它基因的缺失突变体没有表现出与野生型03-8明显的差异。