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脂肪酶GZEL(Gibberella zeae lipase,以下简称GZEL)是由禾谷镰孢菌FGL1基因编码的一种胞外脂肪酶。针对该酶,我们研究团队前期已经对该酶的部分酶学性质进行了表征。然而,以往的研究主要从酶蛋白自身角度出发来考察其基本酶学特性和结构功能关系,对于各种外界环境对酶蛋白活性发挥的影响方面信息尚缺乏。本论文尝试从外界环境对酶蛋白活性的影响角度出发,探究不同外界环境(表面活性剂、pH、盐离子浓度等)条件对GZEL脂肪酶活性的影响规律。此外,基于跟该酶同一家族的棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginous lipase,以下简称TLL)在最适反应pH条件上的巨大差异这一实验现象,本论文尝试从分子水平解析导致其最适反应pH值差异性产生的分子基础及调控机制。本研究结果对于深入了解GZEL的酶学性质和结构功能关系,以及针对该酶的进一步分子改造和催化应用奠定重要基础。具体开展研究内容以及结果如下:(1)开展不同表面活性剂存在条件下GZEL的催化行为研究。分别以三辛酸甘油酯和磷脂酰胆碱为水解底物,利用自动电位滴定法测定不同类型及浓度的表面活性剂对GZEL的脂肪酶活力和磷脂酶活力及其最适反应pH条件的影响规律。研究发现:阴离子型和阳离子型表面活性剂对该酶的脂肪酶活力和磷脂酶活力发挥均起抑制作用,并且随着浓度增加,抑制作用表现更为显著,浓度高于其相应临界胶束浓度条件下将导致酶蛋白活力完全丧失;在阴离子型表面活性剂(N-月桂酰肌氨酸钠、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠)存在情况下,GZEL发挥磷脂酶活力的最适pH由6.0变为7.0。不同非离子型表面活性剂在低于其各自临界胶束浓度条件下对GZEL酶活力发挥所起调控作用不同:7.0 m M浓度条件下,辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷使该酶的脂肪酶活力提高22.97%,磷脂酶活力提高3.11%;而在0.05 m M浓度条件下,Triton X-100使该酶脂肪酶活力降低4.05%,磷脂酶活力提升0.14%;在高于Triton X-100临界胶束浓度条件(0.2 m M)下,酶蛋白仍保留50%左右酶活力,但在高于辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷临界胶束浓度条件下(35.0 m M),其活性则完全丧失。两性离子型表面活性剂(3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)和十二烷基磺丙基甜菜碱(Sulfobetaine 12)对GZEL酶活力影响最大,即使在低浓度条件下(2.0 m M)也会导致酶蛋白完全失活。(2)开展GZEL对不同结构磷脂单分子层的界面吸附特性研究。从界面吸附角度探究不同极性头部及脂肪酸链长脂质结构对酶蛋白界面吸附特性的影响规律,为解析该酶的底物选择性提供帮助。结果表明:在四种带有不同头部基团的磷脂中,GZEL对1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DMPC)的MIP值(最大插入压力)最低,表明该酶对DMPC的亲和力较其它底物要低。测得酶蛋白对于sn-1和sn-2位置分别具有12个和18个碳原子酰基链长的1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DLPC,43.7±1.8 m N/m)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC,43.3±1.2 m N/m)的MIP显著高于其它酰基链长磷脂酰胆碱组(P<0.05),而酶蛋白对1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC)与1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DAPC)的MIP值之间无显著性差异(P>0.05)。此外,相比于饱和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC,36.1±2.0 m N/m),酶蛋白对于含有两个单不饱和双键的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)的MIP值(43.3±1.2 m N/m)显著提高(P<0.05)。(3)开展外界环境因素对GZEL界面吸附特性影响研究。从界面吸附角度探究水相中不同pH环境和盐离子浓度对酶蛋白界面吸附特性的影响规律。结果表明:pH 5.0和pH6.0条件下测得酶蛋白对于1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DMPE)单分子层的MIP值之间没有显著差异(P>0.05)。当水相缓冲液pH值降低为4.0或升高为9.0时,蛋GZEL对DMPE的MIP值均显著降低(P<0.05),呈现典型的钟形曲线。圆二色谱分析表明当pH值为9.0时,GZEL中α-helix的比例显著降低。GZEL对于DMPE的亲和力随Na Cl离子浓度的增加而显著降低。(4)开展GZEL最适反应pH调控的分子机制研究。探究C末端肽段QATDACS序列对于该酶最适反应pH的调控作用,并解析其调控机制。结果发现:将GZEL脂肪酶C-末端QATDACS片段替换为GLIGTCL后,GZEL发挥脂肪酶活性的最适反应pH由原来5.0提高到了7.0,而在最适pH下的脂肪酶活力并没有明显变化;突变体D265G的最适pH由5.0上升到7.0,同时在最适pH下测得的酶活力却没有明显变化。在此基础上,继续设计单点突变D265A和D265R。结果发现:D265A突变体的最适反应pH由原来5.0提高到了7.0,而D265R突变体最适反应pH由原来5.0提高到了9.0,同时酶活力与野生型相比没有明显变化,进一步验证了该位点的最适反应pH调控作用。结合不同突变体酶蛋白表面电势分析结果,尝试对该位点的pH调控机制进行解析。