论文部分内容阅读
早在二十世纪早期就发现,由于肠道的营养摄入某种能刺激胰腺内分泌的物质的释放,从而降低血液的葡萄糖水平。这种物质称为肠促胰岛素,主要包括葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽(GIP)和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。肠促胰岛素诱导口服葡萄糖耐量试验中释放的胰岛素,明显多于等量静脉葡萄糖耐量试验所释放的胰岛素。肠促胰岛素诱导的胰岛素占餐后胰岛素分泌总数的50-70%。GIP和GLP-1通过与各自的受体相结合,增加在胰腺p细胞胞内cAMP水平,促进了胰岛素分泌。除此以外,GIP和GLP-1通过抑制胰腺p细胞凋亡、促进p细胞增殖,以维持胰腺p细胞的量。GIP是一个42个氨基酸的肽,由肠道K细胞分泌,在餐后15-30分钟达到高峰,并迅速被蛋白酶水解酶二肽基肽酶4(DPP IV)分解或水解成无效的产物。GIP/GIPR轴功能受损已成为糖尿病的发病机制之一,因此本研究以受损的GIP/GIPR轴为诱因,诱导糖尿病模型的建立。猪与人有相似的生理学和病理生理学特征,相比于啮齿类是很好的大动物模型。我们构建GIPRdn转基因猪：通过对人GIPR的改造,使其保留与配体正常结合,而失去内在活性,从而发挥显性抑制GIPR的功能；使用体细胞核移植技术建立转基因小猪,通过对其表型的分析,明确其糖尿病的基本特征。本研究构建了国内首个GIPRdn转基因猪,可作为人类糖尿病研究和抗糖尿病药物筛选的模型。第一部分过表达的显性抑制的GIPR质粒的构建目的：构建过表达的显性抑制的GIPR质粒。方法：人GIP受体的cDNA在编码区第三个G蛋白结合环中第340号氨基酸进行定点突变(1018-1020bp,Ala→Glu),同时删除这段序列中的与信号传导相关的8个氨基酸,使GIPR结合活性保留,丧失传导信号通路的功能。构建质粒包括大鼠胰岛素2的启动子和改造后的人的GIP受体,质粒经转化后电泳筛选,最后经过测序确认。结果：将hGIPRdn and Pnmu102通过重组构成包括大鼠胰岛素2的启动子和改造后的GIPR过表达质粒。结论：过表达的显性抑制的GIPR质粒构建成功。第二部分过表达的显性抑制的GIPR(GIPRdn)转基因猪的构建目的：构建过表达的显性抑制的GIPRCGIPRdn)转基因猪。方法：用lipofactamin2000将GIPRdn质粒转染至雄性猪成纤维细胞,并进行G418筛选。使用体细胞核移植法将转染后的细胞发育成的囊胚转移到受体猪子宫角。并对出生后的小猪进行基因鉴定,RT-PCR测定GIPRdn在胰腺组织中的表达。结果：转染GIPRdn质粒的猪胚胎成纤维细胞经PCR鉴定为阳性。通过体细胞核移植技术产生了7只GIPRdn转基因猪。结论：过表达的显性抑制的GIPR转基因猪构建成功。第三部分表型分析过表达的显性抑制的GIPR(GIPRdn)转基因猪目的：过表达的显性抑制的GIPR(GIPRdn)转基因猪糖耐量表型分析和胰腺发育分析。方法：用2月和5月龄野生型和GIPRdn转基因猪进行口服葡萄糖耐量试验,并分析血糖和胰岛素量。将分离的胰腺称重,用免疫组化的方法分析野生型和GIPRdn转基因猪胰腺的insulin和Ki67的表达。结果：2月龄GIPRdn转基因猪的口服葡萄糖耐量试验中胰岛素曲线下面积是野生型的2.3倍(P=0.02)。5月龄野生型和GIPRdn转基因猪的口服葡萄糖耐量试验中胰岛素曲线下面积没有显著性差异。5月龄GIPRdn转基因猪的胰岛素曲线下面积比2月龄时下降44%,而2次试验的胰岛素曲线外观是相似的。5月龄GIPRdn转基因猪的胰腺重量比同龄的野生型猪减少了44%。结论：过表达的显性抑制的GIPR转基因猪表现出糖耐量受损和胰腺发育障碍。