现今,胃癌位于我国癌症相关死亡的第三位。2010年我国胃癌发病率为30.77/10万,占新发癌症的13.08%。近年来,虽然靶向治疗和免疫治疗进展迅速,但化疗仍然是晚期胃癌患者最有效的治疗方法。肿瘤组织内的血管生成可帮助肿瘤细胞存活和侵袭,在肿瘤生长和转移的过程中发挥着重要的作用。血管内皮生长因子-A(Vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)是调节血管生成的关键因子之一,VEGF-A及其受体为抗血管生成药物的作用靶点。加用抗血管生成药物治疗后,胃癌患者的生存期较单用化疗虽然仅延长了约2个月,但抗血管生成治疗仍然是胃癌目前最有前景的治疗方法之一。由于抗血管生成药物效果不尽人意,因此,筛选出对抗血管生成治疗敏感的患者,提高治疗的有效率是广大肿瘤科医生所面临的难题。粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)通过与粒细胞集落刺激因子受体(Granulocyte colony-stimulating factor receptor,G-CSFR)相结合,促进骨髓中性粒细胞的产生、成熟和释放入血。重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colonystimulating factor,rhG-CSF)被广泛用于放化疗引起的粒细胞减少症。体外研究显示肿瘤细胞和肿瘤间质细胞也可产生G-CSF,且G-CSF可促进肿瘤细胞的增殖和转移。肿瘤组织产生G-CSF的患者在确诊时多已属晚期,且疾病进展迅速、生存期短。文献报道G-CSF还可导致肿瘤对抗VEGFA治疗耐药,抑制G-CSF后可减少肿瘤血管生成、抑制肿瘤生长。因此,G-CSF是预测肿瘤患者预后以及预测抗血管生成药物效果的潜在生物学标志物。目前,G-CSF和G-CSFR在胃癌患者及胃癌细胞中的表达情况及其作用尚缺少研究。本研究分别以胃癌患者血清、胃癌组织,胃癌细胞株和血管内皮细胞株为研究对象,先后采用了免疫组织化学、酶联免疫吸附试验(Enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)、蛋白印迹法(Western Blotting)、实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、CCK-8、细胞划痕、Transwell小室以及小管形成实验等实验方法,研究了血清G-CSF在胃癌诊断和判断预后中的价值,胃癌组织G-CSF和G-CSFR的表达情况及其与临床病理特征、胃癌血管生成、患者生存期等的关系,G-CSF对胃癌细胞和血管内皮细胞生物学行为的影响等,阐述了G-CSF和G-CSFR在胃癌发展中的作用,为胃癌诊断、判断预后和筛选抗血管生成治疗耐药患者提供了新的生物学标记物。第一部分胃癌患者血清G-CSF水平及临床意义目的:检测未经治疗的胃癌患者血清G-CSF水平,分析其诊断胃癌的敏感性,与临床病理特征、患者预后等的关系,探讨其在胃癌诊断和判断预后中的价值。方法:1.收集60例胃癌患者和40例健康志愿者空腹外周血。采血前所有患者均未接受过手术及任何抗肿瘤治疗,对所有患者进行随访。2.采用ELISA法检测血清G-CSF水平。3.分析血清G-CSF诊断胃癌的敏感度与特异度,分析其与临床病理特征及患者预后等的关系。结果:1.胃癌患者血清G-CSF水平显著高于健康人群。2.随着TNM分期的增加,胃癌患者血清G-CSF水平逐渐降低,Ⅰ期患者血清G-CSF水平显著高于Ⅳ期患者。血清G-CSF水平与患者性别、年龄、胃癌Lauren分型、分化程度、局部浸润深度以及淋巴结转移等因素无关。3.血清G-CSF诊断胃癌的敏感度(58.3%)与CA724(40.0%)相似,显著高于CEA(36.7%)和CA199(26.7%)。4.血清G-CSF水平与外周血中性粒细胞水平无关。5.血清G-CSF水平与胃癌患者生存期无相关性。小结:1.胃癌患者血清G-CSF水平较健康人群明显升高,对诊断胃癌具有一定的敏感度。2.Ⅰ期到Ⅳ期胃癌患者血清G-CSF水平逐渐降低,提示血清G-CSF升高发生在胃癌发展早期。第二部分胃癌组织G-CSF、G-CSFR的表达及临床意义目的:检测未经治疗胃癌患者胃癌组织和正常胃黏膜组织G-CSF和G-CSFR的表达,分析其与临床病理特征、胃癌组织血管生成、患者预后等的关系,探讨在其胃癌发展过程中的作用。方法:1.收集术前未经抗肿瘤治疗胃癌患者的术后标本,其中胃癌组织70例和癌旁正常胃黏膜组织30例,采用免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测G-CSF和G-CSFR表达强度。胃癌组织采用IHC同时检测VEGF-A和CD34表达,通过计数CD34标记的血管内皮细胞计算微血管密度(microvascular density,MVD)。2.收集40例术前未经抗肿瘤治疗胃癌患者的新鲜胃癌组织和配对癌旁正常胃黏膜组织。采用ELISA法检测两种组织中G-CSF和G-CSFR表达量,以及胃癌组织中VEGF-A表达量。3.分析胃癌组织与正常胃黏膜组织G-CSF、G-CSFR表达水平的差异。4.分析G-CSF、G-CSFR表达与胃癌临床病理特征、VEGF-A、MVD以及患者预后等的关系。结果:1.IHC检测显示:与正常胃黏膜组织相比,胃癌组织G-CSFR高表达率明显升高,而G-CSF高表达率无明显变化。胃癌组织G-CSF表达强度与TNM分期显著正相关,G-CSFR表达强度与淋巴结转移显著正相关。G-CSF、G-CSFR表达强度与性别、年龄、肿瘤分化程度、Lauren分型、浸润深度等因素无关。胃癌组织G-CSF与G-CSFR的表达强度呈弱的正相关性。2.ELISA检测显示:与配对癌旁正常胃黏膜组织相比,胃癌组织GCSFR表达量显著升高,而G-CSF表达量无明显变化。胃癌组织G-CSF和G-CSFR表达量呈显著正相关。3.胃癌组织VEGF-A与G-CSFR表达呈显著正相关,但与G-CSF表达无关。4.与低表达G-CSFR的胃癌组织相比,高表达G-CSFR的胃癌组织MVD显著升高,而G-CSF高表达与低表达胃癌组织的MVD无显著差异。5.IHC检测显示:胃癌组织高表达G-CSF患者的生存期较低表达患者明显缩短[中位生存期(95%CI):25.6月(18.7月~32.5月)vs.46.5月(36.9月~44.4月),P=0.006];胃癌组织高表达与低表达G-CSFR患者的生存期无明显差异[中位生存期(95%CI):34.7月(30.7月~38.6月)vs.46.3月(39.6月~53.1月),P=0.053]。6.ELISA检测显示:以胃癌组织G-CSF水平115.0pg/ml作为截断值将患者分为2组,G-CSF表达量>115.0pg/ml组患者生存期较≤115.0pg/ml组患者的生存期明显缩短[中位生存期(95%CI):26.3月(17.1月~35.5月)vs.37.1月(34.1月~40.1月),P=0.004]。以胃癌组织G-CSFR表达量469.0pg/ml作为截断值将患者分为2组,G-CSFR表达量>469.0pg/ml组比≤469.0pg/ml组患者的生存期明显缩短[中位生存期(95%CI):30.3月(24.6月~36.0月)vs.39.1月(38.1月~39.8月),P=0.010]。小结:1.与正常胃黏膜组织相比,胃癌组织G-CSFR表达显著升高,G-CSF表达无明显变化。胃癌组织中G-CSF和G-CSFR表达呈正相关。2.G-CSF表达强度与TNM分期显著相关,G-CSFR表达强度与淋巴结转移显著相关,提示G-CSF和G-CSFR的表达可能促进胃癌进展。3.胃癌组织G-CSFR与VEGF-A、MVD呈显著正相关,提示G-CSFR表达升高可促进胃癌组织血管生成,促VEGF-A生成可能为其促血管生成机制之一。4.胃癌组织G-CSF、G-CSFR表达与患者生存期相关,高表达G-CSF或G-CSFR的患者生存期缩短。第三部分G-CSF对胃癌细胞SGC7901和AGS生物学行为的影响及机制目的:研究G-CSF对胃癌细胞生物学行为的影响及机制。方法:1.通过qRT-PCR和Western Blotting检测4株胃癌细胞和1株正常胃黏膜细胞G-CSF、G-CSFR的表达水平,筛选出G-CSFR相对高表达的SGC-7901和AGS胃癌细胞株进行后续研究。2.通过CCK-8实验,研究G-CSF对胃癌细胞增殖活性的影响。3.qRT-PCR和Western Blotting检测PCNA表达水平,研究G-CSF对胃癌细胞PCNA表达水平的影响。4.通过细胞划痕和Transwell实验,研究G-CSF对胃癌细胞迁移和侵袭的影响。5.通过qRT-PCR和Western Blotting检测G-CSFR表达水平,研究GCSF对胃癌细胞G-CSFR mRNA和蛋白表达水平的影响。6.通过Western Blotting检测Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2),信号传导与转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)和磷酸化STAT3的蛋白水平,研究G-CSF对胃癌细胞JAK2/STAT3信号通路的影响。结果:1.G-CSF干预后胃癌细胞SGC-7901和AGS增殖活性和PCNA表达水平比对照组明显升高。2.G-CSF干预后胃癌细胞SGC-7901和AGS迁移和侵袭的能力明显增加。3.G-CSF干预后胃癌细胞SGC-7901和AGS G-CSFR mRNA和蛋白表达水平明显升高。4.G-CSF可使胃癌细胞SGC-7901和AGS中磷酸化STAT3和JAK2蛋白水平上调,阻断G-CSFR可抑制其作用。小结:1.G-CSF可上调胃癌细胞G-CSFR表达水平。2.通过结合G-CSFR,G-CSF可激活JAK2/STAT3信号通路,促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。第四部分G-CSF对血管内皮细胞HUVEC生物学行为的影响目的:研究G-CSF对血管内皮细胞生物学行为的影响。方法:1.通过CCK-8实验,研究G-CSF对血管内皮细胞HUVEC增殖活性的影响。2.qRT-PCR和Western Blotting检测PCNA表达水平,研究G-CSF对血管内皮细胞HUVEC PCNA表达水平的影响。3.通过细胞划痕和Transwell实验,研究G-CSF对血管内皮细胞HUVEC迁移和侵袭的影响。4.通过小管形成试验研究G-CSF对HUVEC细胞小管形成能力的影响。结果:1.G-CSF干预后血管内皮细胞HUVEC增殖活性和PCNA表达水平较对照组无明显变化。2.G-CSF干预后血管内皮细胞HUVEC的迁移和侵袭能力明显增加。3.G-CSF干预后血管内皮细胞HUVEC成管能力明显增强,并呈剂量依赖性。小结:G-CSF可促进血管内皮细胞的迁移、侵袭和管腔形成。结论:1.胃癌患者血清G-CSF的水平显著高于健康人群,诊断胃癌的敏感度与CA724相似,优于CEA和CA199。随着TNM分期的增加,胃癌患者血清G-CSF水平逐渐降低,Ⅰ期患者血清G-CSF水平显著高于Ⅳ期患者。2.胃癌组织G-CSFR表达较正常胃组织明显升高,而G-CSF无明显变化。胃癌组织高表达G-CSF、G-CSFR患者的生存期明显缩短。3.胃癌组织G-CSF表达强度与TNM分期显著正相关,G-CSFR表达强度与淋巴结转移、VEGF-A、MVD呈显著正相关。4.G-CSF通过结合G-CSFR,激活JAK2/STAT3信号通路,促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。5.G-CSF促进血管内皮细胞迁移、侵袭和成管。