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研究背景脑胶质瘤是一种常见的颅内肿瘤,其占颅内肿瘤的50%-60%。恶性胶质瘤占中枢神经系统恶性肿瘤的81%,其中包括胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM),平均生存期14个月,几乎是一种致命性疾病。尽管现在诊断工具和治疗方法不断提高,但恶性胶质瘤的生存期没有得到明显的改善,其原因是发病因素多以及发病机制尚不完全清楚。动物模型作为一种研究疾病的工具,在研究肿瘤发病机制、治疗效果以及临床前实验发挥着巨大作用。目前,脑胶质瘤动物模型成瘤周期长,成瘤不稳定等缺陷限制了其应用,因此建立一种新型的,高度拟合人脑胶质瘤发生、发展的动物模型,对未来胶质瘤的研究有重要的意义,如胶质瘤发病机制研究、开发新的治疗手段以及临床前药物试验等。近年来,有研究指出,叙利亚仓鼠是评估肿瘤靶向性腺病毒和人类炎症细胞因子抗肿瘤作用的有效模型。目前,免疫治疗以及融肿瘤腺病毒治疗等新型的治疗方法在胶质瘤领域研究较少,叙利亚仓鼠模型在免疫治疗和溶肿瘤腺病毒治疗的优势可成为该研究方向的首选模式动物。此外,叙利亚仓鼠生殖周期短,繁殖快;体型较大,利于实验操作;对可诱发肿瘤的病毒有易感性;解剖学和生理学与人相似等特征使其成为一种很有潜力的模式动物。因此建立一种新型的脑胶质瘤叙利亚仓鼠模型,对胶质瘤的发病机制研究、开发新的治疗手段以及临床前药物试验有重要的意义,该模型或许可以成为未来提高胶质瘤生存率的一个有效工具。目的鉴于Tp53和RAS通路异常是GBM常见的分子变化,本课题用携带有叙利亚仓鼠KRAS基因突变体KRASG12D的慢病毒(lentivirus,LV)感染Tp53基因纯合缺失或杂合缺失的叙利亚仓鼠脑部,从而建立叙利亚仓鼠脑胶质瘤模型,并对该模型的临床表现、病理学特征等进行研究,比较该方法建立的脑胶质瘤模型与人脑胶质瘤的相似程度,为脑胶质瘤的研究提供与临床相似的动物模型以及为疾病研究提供科学依据。方法本研究采用慢病毒注射脑组织手术的方式建立模型,建模手术完成后监测体重的变化,利用动物活体成像技术记录肿瘤的形成,分析生存期以及进行疾病评分等方法对胶质瘤模型进行初步研究,再观察仓鼠脑组织病变形态以及进行病理学分析等对肿瘤种类以及恶性程度进行评估。具体研究方法如下:(1)构建KRAS突变质粒。第二代带有荧光素酶(Luciferase)报告基因,绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因的慢病毒载体质粒作为骨架插入叙利亚仓鼠KRAS基因突变体KRASG12D,构建命名为FUB-KRASG12D的载体主质粒。(2)生产KRASG12D慢病毒以及空载体慢病毒。以方法1构建的质粒和空载体质粒作为慢病毒载体主质粒,利用第二代慢病毒包装系统生产KRASG12D慢病毒和空载体慢病毒,浓缩病毒后检测病毒滴度。(3)建立脑胶质瘤动物模型。将基因型明确的叙利亚仓鼠分为A、B、C、D四个组,A组和B组仓鼠基因型为野生型(WT),C组仓鼠为Tp53基因杂合缺失型(p53+/-),D组仓鼠为Tp53基因纯合缺失型(p53-/-),A组为对照组,进行空载体慢病毒注射手术,B、C、D组为实验组,进行KRAS G12D慢病毒注射手术,每组7只,在仓鼠3周龄至4周龄时进行脑部注射慢病毒手术,手术后每天观察仓鼠的状态,每周记录一次仓鼠重量和一次小动物活体成像(4)肿瘤模型临床病理分析。术后叙利亚仓鼠出现体重骤减,自主觅食减少,倦怠少动,震颤,头顶部有突出样改变或者出现濒死状态时,处死仓鼠取脑组织进行形态学观察和病理学检测。结果(1)通过Sanger测序证明成功构建了 KRASG12D载体质粒,该载体质粒以及空载体质粒作为包装慢病毒的主质粒进行慢病毒包装,生产慢病毒,病毒浓缩后采用流式分析方法检测KRAS G12D慢病毒滴度为1.28×107PFU/mL,空载体慢病毒滴度为 8.72×1 06PFU/mL。(2)各组动物在3-4周龄进行慢病毒脑部注射手术。模型体重结果显示,A组和B组体重平均值最大,C组次之,D组体重平均值最小,各组相对应的生存曲线也呈相同趋势,A组和B组生存率100%,C组生存率42.8%,,D组生存率最低,为14.2%。小动物活体成像技术检测的荧光表达强度结果显示:四个组都有不同程度的荧光表达,但荧光表达强度不同:A组和B组在同一时期荧光表达强度最弱,在后期荧光表达增幅小,甚至出现荧光表达强度减弱的趋势;C组和D组的荧光表达强度在整体上差别不大,但总体上看C组在后期的荧光表达强度增幅小,D组荧光表达强度增幅稍大。(3)模型建立30天到50天仓鼠出现比较严重的脑胶质瘤发病症状,包括行动迟缓,倦怠少动,震颤,偏瘫和濒死等,取发病叙利亚仓鼠脑组织,形态学观察显示,与未发病仓鼠脑组织相比,大体观发病仓鼠脑组织有不同程度变形,如异常凸起,左右脑形状不对称等,且注射部位有发黑现象,纵切剖面观察到局部坏死。HE染色结果显示,发病仓鼠的脑部肿瘤组织有坏死和出血区域,肿瘤组织边缘界限模糊,呈浸润性生长,细胞密度大,细胞核呈圆形或者不规则形,核分裂相多见,细胞质较少,核质不均一等特点。结论(1)Tp53基因纯合缺失或者杂合缺失协同KRAS基因突变体KRAS G12D的表达可诱导叙利亚仓鼠发展脑胶质瘤;(2)单纯KRAS基因突变不能诱导叙利亚仓鼠发展脑胶质瘤;(3)该方法模型建立时间较短,平均时间为42天;(4)仓鼠脑部肿瘤组织有大面积坏死病变,细胞形状不规则,多见细胞核分裂相,核质不均一等特征,与人类脑胶质瘤病理学状态相似,因此可作为一种理想的脑胶质瘤动物模型。