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背景:胃癌是肿瘤致死率全球排名第二的肿瘤,也是中国人群常发的恶性肿瘤。近年尽管人们在手术、化疗、放疗等治疗手段上做出了很多的改进,然而全球胃癌患者的平均五年存活率仍在10%以下。其中,肿瘤的复发和转移是胃癌治疗的最大障碍。研究者们已经从多个层面阐述胃癌发病的分子机制,包括基因突变、基因拷贝数变异、基因选择性剪切、基因融合、nc RNA以及表观遗传调控异常等等,但对胃癌的发生发展以及转移的具体分子机制仍然不清楚。近年研究发现,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要的调控作用。随着对lnc RNA结构解析和功能研究的深入,研究者发现lnc RNA在胃癌中以多种机制参与调控胃癌细胞的多种生物学功能,有望成为胃癌诊治的新的候选靶分子。目的:本研究以lnc RNA UCA1为候选分子,探讨UCA1在胃癌进展中的生物学作用及其分子调控网络,以期深入理解lnc RNA在胃癌发生发展中的贡献。方法:1.采用基于R语言的limma包分析GEO数据库中胃癌组织样本lnc RNA芯片表达矩阵,下载The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库中的胃癌组织测序数据,利用基于R语言的edge R包分析UCA1差异表达情况;通过q PCR的实验方法检测UCA1在60对胃癌病例组织中的表达情况,分析UCA1的表达水平与胃癌临床病理参数之间的相关性,通过q PCR的实验方法检测UCA1在胃癌细胞系中的表达水平;利用RNA-seq技术对干扰UCA1之后的胃癌细胞系BGC-823进行转录组测序,以基因本体(Gene Ontology,GO)分析寻找UCA1可能参与的信号通路。2.通过慢病毒技术建立稳定干扰和过表达UCA1的细胞模型,应用划痕实验和Transwell小室实验检测UCA1在体外对胃癌细胞系迁移和侵袭的影响,利用小鼠尾静脉注射实验研究UCA1在体内对胃癌细胞系迁移的影响,HE染色检测转移灶的形成,q PCR和Western Blot检测迁移相关分子标志物的变化。3.细胞核、细胞质RNA分离实验研究UCA1在细胞中的定位,生物信息学方法构建UCA1参与的吸附调控网络,寻找UCA1通过吸附mi RNA的方式影响的靶分子,并且通过luciferase实验、RNA pull down实验证明UCA1和mi R-203的物理结合,luciferase实验证明mi R-203对ZEB2的抑制是否通过结合ZEB2的3′UTR,RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验证明mi R-203是否通过Ago-2途径抑制ZEB2表达水平。通过q PCR和Western Blot拯救实验研究UCA1对ZEB2的调控是否依赖于吸附mi R-203。结果:1.分析本课题组已获得的胃癌差异表达lnc RNA芯片结果和GEO数据集中2个独立的lnc RNA表达谱,发现lnc RNA UCA1的表达水平明显升高,且排位第一。TCGA数据库中进一步验证了UCA1的表达趋势与以上芯片结果分析相同。2.在60对新鲜胃癌病例组织中分析UCA1的表达水平,发现UCA1在胃癌肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁组织(p<0.001),UCA1在胃癌组织中的平均表达水平是癌旁组织的18倍。分析UCA1的表达水平与胃癌临床病理参数之间的相关性,发现UCA1的表达水平与胃癌的淋巴结转移(p=0.038)和年龄(p=0.027)呈现明显的相关性。3.通过RNA-seq技术对干扰UCA1之后的胃癌细胞系BGC-823进行测序,GO分析寻找UCA1可能参与的信号通路,结果显示,干扰UCA1之后,细胞信号通路的变化主要集中在adhesion、adhesion junction、anchoring junction。4.在胃癌细胞系BGC-823中过表达UCA1可以诱导细胞产生上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)表型。在过表达UCA1的胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901中,以Western Blot检测与EMT相关的经典标志物发现,Epithelial marker(E-cadherin和β-catenin)明显降低,而Mesenchymal marker(Vimentin和N-cadherin)明显上升。5.划痕实验、Transwell小室实验结果显示,过表达UCA1之后会促进胃癌细胞系SGC-7901和BGC-823的迁移和侵袭能力;敲低UCA1表达会抑制胃癌细胞系SGC-7901和BGC-823的迁移和侵袭能力。6.裸鼠尾静脉注射实验证明在胃癌细胞系SGC-7901中过表达UCA1之后可以明显的促进胃癌细胞的肝转移,相反,在胃癌细胞系BGC-823中敲低UCA1的表达之后可以明显的抑制胃癌细胞的肝转移。7.细胞核/细胞质分离实验发现UCA1主要定位在细胞质中。通过构建UCA1参与的吸附网络,结合在胃癌细胞系BGC-823中干扰UCA1之后的测序结果,挑选受UCA1影响的候选靶分子ZEB2,干扰UCA1之后在转录水平和蛋白水平均可以抑制ZEB2的表达,而过表达UCA1之后可以提高ZEB2的表达水平。通过吸附调控网络发现UCA1对ZEB2的调控是通过吸附mi R-203,从而解除了mi R-203对ZEB2的抑制作用。8.Luciferase实验、RNA pull down实验表明UCA1和mi R-203是物理结合,luciferase实验显示mi R-203通过结合ZEB2的3′UTR抑制ZEB2的表达,RIP实验表明mi R-203可以通过Ago-2途径抑制ZEB2表达水平。9.通过拯救实验发现,在稳定过表达UCA1的胃癌细胞系SGC-7901和BGC-823中转染mi R-203 mimics可以使ZEB2的表达水平下调,在稳定干扰UCA1的胃癌细胞系SGC-7901和BGC-823中转染mi R-203 inhibitor之后,可以使ZEB2的表达水平恢复,这些结果提示,UCA1对ZEB2的调控是依赖于吸附mi R-203。结论:1.UCA1在胃癌组织中显著高表达,UCA1的表达水平与胃癌的淋巴结转移呈明显的正相关,提示UCA1有可能成为胃癌诊断和检测疾病进展的生物标志物。2.高表达的UCA1可以促进胃癌细胞的侵袭和转移,结合干扰UCA1测序GO分析结果,提示UCA1有望成为胃癌侵袭转移的治疗靶点。3.UCA1对ZEB2的调控是通过吸附mi R-203实现,UCA1/mi R-203/ZEB2轴的提出有助于深入理解胃癌侵袭转移的发生机制并且为研发新的肿瘤药物提供理论基础。背景:染色体20q13.33区域的扩增与胃癌的发生发展密切相关。linc00659位于20q13.33区域且与结肠癌细胞的生长有关,但与胃癌发生及进展是否相关尚不清楚。目的:染色体20q13.33区段上差异表达的lnc RNA linc00659与胃癌患者生存时间的相关性分析,以及其对胃癌细胞侵袭和迁移的影响研究,为胃癌诊治提供可能的新的诊断标志物和潜在的治疗靶点。方法:1.下载胃癌TCGA表达数据,使用edge R包对染色体区段20q13.33上的lnc RNA进行差异表达分析,并且根据linc00659表达水平将胃癌患者分成linc00659高表达组和linc00659低表达组,分析linc00659表达高低与胃癌患者生存时间之间的相关性,分析linc00659表达高低与胃癌临床分期之间的相关性。2.通过q RT-PCR的方法分析60对胃癌组织和癌旁组织中linc00659的表达水平,分析linc00659与胃癌淋巴结转移之间的相关性。通过q RT-PCR检测linc00659在胃癌细胞系中的表达情况。3.通过GSEA富集分析linc00659高表达组和linc00659低表达组之间细胞通路的变化,以推测linc00659参与胃癌发生发展过程的细胞生物学功能。4.稳定干扰linc00659在胃癌细胞系AGS和MKN-74中的表达,通过划痕实验和Transwell小室实验研究linc00659表达抑制对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:1.经过分析发现,20q13.33染色体区段含有18条lnc RNA,其中4条lnc RNARTEL1-TNFRSF6B,linc00659,SLCO4A1-AS1,ZBTB46-AS1存在差异表达,其中linc00659与胃癌患者的生存时间有相关性。通过分析TCGA数据库中的胃癌临床病理信息发现,linc00659的表达水平与肿瘤的分期有明显的相关性。2.q RT-PCR方法检测linc00659在60对新鲜胃癌组织和癌旁组织中的表达水平,结果发现,与癌旁组织相比较,linc00659在癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织,并且在有淋巴结转移的胃癌病例组织中,癌组织中linc00659的表达水平明显高于癌旁组织。3.与胃粘膜永生化细胞GES-1相比,linc00659在胃癌细胞系中均表达上调。4.基于生物信息学的分析,推测linc00659可能主要参与细胞黏附相关的通路。5.划痕和Transwell小室实验显示,干扰linc00659之后胃癌细胞系AGS和MKN-74的侵袭和迁移的能力受的明显的抑制。结论:linc00659在胃癌组织和胃癌细胞系中均为高表达,提示linc00659在胃癌的发生发展中可能起癌基因的作用。linc00659的高表达与胃癌患者的淋巴结转移和临床分期呈正相关,与患者预后不良有关。linc00659可能参与胃癌细胞的迁移和侵袭能力。