血管形成(Angiogenesis)是由内皮细胞和血管平滑肌增殖而形成新生血管的过程，成年后基本退化，但可被某些因素(如外伤、肿瘤、糖尿病视网膜病变)所激活，任何实体肿瘤的生长与转移都有赖于新生肿瘤血管的形成，在无新生血管形成的条件下只能停滞于直径1～2mm。肿瘤组织本身及其周围基质都可以分泌血管形成的促进因子和抑制因子，这两方面的失衡决定了血管形成和肿瘤的发展和转移，肿瘤血管形成由刺激因素(如VEGF、bFGF等)和抑制因素(如血管抑素、内皮抑素等)的平衡所决定(称为血管形成开关)。用抗肿瘤血管形成的方法切断肿瘤的血液供应，就能抑制肿瘤生长，达到治疗作用。内皮抑素(Endostatin，ES)具有很强的抗肿瘤血管形成作用，具有直接的靶向性，毒性低，且反复应用也不产生耐药性，在体外实验取得了良好的效果。为了保持肿瘤抑制，必须持续应用血管形成抑制剂，但是蛋白的纯化仍是技术难题，而且需长期用药、费用昂贵而不便。通过基因治疗的方法可以持续产生有效的抗血管形成抑制剂，因此，我们构建了一个携带内皮抑素基因的重组腺病毒载体。重组腺病毒为一良好的转基因载体，没有致病性，为DNA病毒，不发生插入突变，载体操 天津医科大学俘d二学位论文作方便，宿主广泛，容易增殖，携带外源基因容量大，可以表达接近翻译后成熟水平的蛋白质。 肿瘤血管形成是膀肤癌预后不良的重要标志，故抑制肿瘤血管形成应当对膀肤癌治疗有重要作用，且其局部治疗更具优势。本课题拟就ES对膀肤癌生长的抑制作用作一些基础性研究，为最终的临床应用打下坚实的基础。 论文的第一部分:含内皮抑素基因的腺病毒穿梭质粒的构建。根据Genbank查到的 ES序列设计特异的上下游引物，应用逆转录PCR (RT一PCR)的方法制备扩增其DNA片段(含有与空的穿梭质粒pAdTraCk一CMv一致的限制性内切酶)，分别双酶切ES和空的穿梭质粒，再将二者连接，将ES导入腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack一CMV，构建成pAdTrackCMv一ES，再利用宿主细菌内同源重组的方法将pAdTrackcMv一ES与El区缺失的腺病毒骨架质粒pAdEasy一共同转化大肠杆菌BJ5183，构建出重组腺病毒质粒prAd一ES，并在DHIOB中大量扩增。 论文的第二部分:含内皮抑素基因的重组腺病毒的构建。利用脂质体介导将重组腺病毒质粒prAd一ES感染293细胞(人胚胎肾细胞，含有腺病毒复制所必需的E1区)，进行包装和扩增，在荧光显微镜下借助报告基因GFP(绿色荧光蛋白)监控和筛选重组腺病毒rAd一ES。重组病毒在293细胞内传代，收获病毒。采用氯化艳密度梯度离心法纯化病毒，用TCIDS。法滴定重组腺病毒的滴度。 论文的第三部分:观察ES的体内外抑瘤作用。rAd一ES细胞培养上清液对脐静脉血管内皮细胞ECV一304增殖有良好的抑制作用，较对 4 天臼卜医科大学俘.士学位论文照组AdLacZ的作用有明显差异。建立接种了人膀肤癌EJ细胞的裸鼠(SCID)模型。分别将获取的重组腺病毒细胞培养上清液和内皮抑素蛋白进行移植瘤瘤体内注射，均有抑制肿瘤生长的作用，但是前者更为优越。处死小鼠后取肿瘤组织进行流式细胞分析，证实ES可以通过抑制内皮细胞增殖促进肿瘤细胞凋亡。