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背景:低碱性磷酸酯酶症(Hypophospatasia,HPP)是由于非组织特异性碱性磷酸酶(tissue nonspecific alkaline phosphatase,TNSALP)活性降低造成的罕见病。TNSALP在人体中有重要的作用,缺少时会造成人体的骨骼矿化不良,从而出现骨折等症状。2015年FDA批准重组碱性磷酸酶抗体药物(rTNSALP-FcD10)可用于治疗HPP,但目前rTNSALP-FcD10抗体药物还没有在国内上市。rTNSALP-FcD10具有延长半衰期并有利成骨细胞靶向性的特性,但其产量较低、成本高,对HPP病患者的需求及家庭产生较大负担。目的:本项目针对如上问题,查阅文献,本实验拟构建重组TNSALP的真核表达载体,试图筛选出更高效的重组表达质粒,获得能够稳定表达rTNSALP-FcD10蛋白且表达量相对较高的中国仓鼠卵巢细胞株,为今后在中国规模化生产rTNSALP-FcD10蛋白建立基础。方法:(1)去掉TNSALP分子N-末端的信号肽序列及C-末端的GPI锚定信号,并与人抗体的Fc片段和10个天冬氨酸重组成融合蛋白rTNSALP-FcD10,将rTNSALP-FcD10重组基因克隆到载体pcDNA3.1及pEF1/Myc-His B上,以这种方式,构建了重组真核表达载体。脂质体介导法转染CHO-K1细胞,用G418进行细胞压力筛选,获得能够稳定表达rTNSALP-FcD10蛋白并且具有更高表达水平的CHO-K1细胞系。(2)利用rTNSALP-FcD10既含有Ig G抗体亲和片段,同时又是一个糖基化蛋白的特点,通过亲和层析的原理进行纯化,对纯化的重组蛋白进行ALP活性检测和数据分析。结果:(1)重组表达质粒pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10及pEF1-rTNSALP-FcD10经酶切电泳及测序验证证实质粒构建成功。(2)实时荧光定量PCR检测显示,与空白对照组(未转染重组质粒)相比,转染重组表达质粒的两组CHO-K1细胞中,rTNSALP-FcD10基因的转录水平显著增加。且转染pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10质粒组高于转染pEF1-rTNSALP-FcD10质粒组。Western blot实验结果显示rTNSALP-FcD10重组蛋白在CHO-K1细胞中成功表达,且转染pEF1-rTNSALP-FcD10质粒组的蛋白表达水平高于转染的pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10质粒组的蛋白表达水平。(3)通过亲和层析的方法对rTNSALP-FcD10蛋白进行纯化,纯化后蛋白浓度为4.2mg/L。(4)碱性磷酸酶活性检测实验结果显示,转染pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10及pEF1-rTNSALP-FcD10重组表达质粒组的蛋白ALP活性明显高于空白对照组所表达的天然ALP活性。结论:成功构建了rTNSALP-FcD10的重组表达质粒pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10-FcD10及pEF1-rTNSALP-FcD10-FcD10,并建立了稳定转染的CHO-K1细胞系,成功表达目的蛋白。转染pEF1-rTNSALP-FcD10组的CHO-K1细胞比转染pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10组细胞的质粒表达效果更好,所表达的重组蛋白量更高。纯化出rTNSALP-FcD10重组蛋白,并且具有较高的生物活性。为大量表达rTNSALP-FcD10重组蛋白奠定了良好的实验基础。