论文部分内容阅读
背景:瘢痕曾被认为是人类创伤愈合的必然产物,随着烧伤治愈率的提高,深度烧伤创面愈合后瘢痕遗留问题日益成为烧伤整形治疗的主要难题。瘢痕的基本病理学改变是细胞外基质大量堆积,主要是胶原蛋白的无序堆积和比例失衡,成纤维细胞是胶原合成和分泌的主要功能细胞,成纤维细胞的生长增殖、胶原合成活动与瘢痕形成密切相关。胎儿创面无瘢痕愈合现象的发现,提示我们人类创伤也可无瘢痕愈合,有学者发现这一现象与骨形态蛋白(BMPs)相关。BMPs是转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员,最初因其诱导成骨的作用引起人们重视,随着研究的深入,人们发现它是一个多功能因子,在胚胎发生和发育、组织与细胞的分化和增殖等方面起重要作用。BMP-2是BMPs中最活跃的细胞因子之一,与成纤维细胞关系密切,以往研究多集中于骨、关节周围的成纤维细胞,皮肤及瘢痕成纤维细胞尚无深入研究的报道。Stelnicki EJ等研究表明在胎儿皮肤组织里BMP-2低水平表达,而加入外源性BMP-2作用下胎儿创面像成人一样愈合后留有瘢痕,提示BMP-2参与瘢痕形成。实验中Stelnicki EJ发现BMP-2在表皮细胞和成纤维细胞均有表达。BMP-2在成人瘢痕组织中的表达如何?BMP-2在人类瘢痕成纤维细胞内的表达与正常皮肤有无区别?它对瘢痕形成的主要功能细胞—成纤维细胞的增殖、生长及胶原合成功能有无影响?国内外目前还无相关报道,因此我们设计此实验,通过Western blot、RT-PCR等方法检测BMP-2在正常皮肤组织中、成纤维细胞内的表达;并通过寡义核苷酸干扰BMP-2的表达,观察其对成纤维细胞增殖和胶原合成的影响。第一章皮肤、瘢痕及瘢痕疙瘩组织中BMP-2的表达目的:检测BMP-2在正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩组织中的表达。方法:收集54份成人标本,其中正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩各18份,切片,免疫组化染色,观察各组织块内BMP-2的表达,统计分析采用F检验,两组间采用方差分析的两两比较(LSD法)。结果:1、BMP-2在正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩组织中有表达,在表皮细胞、成纤维细胞均有表达。2、BMP-2在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中表达较正常皮肤明显增强,三组标本中BMP免疫染色计分的均数差别有统计学意义(F=6.971,P=0.002),瘢痕疙瘩组与正常皮肤组、增生性瘢痕组与正常皮肤组BMP免疫染色计分的均数差别有统计学意义(P=0.004及P=0.001),但瘢痕疙瘩组与增生性瘢痕组的BMP免疫染色计分的均数差别无统计学意义(P=0.670)。结论:BMP-2在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的表达较在正常皮肤中明显高。第二章皮肤及瘢痕成纤维细胞内BMP-2的表达目的:探讨BMP-2在正常皮肤及增生瘢痕成纤维细胞内的表达情况。方法:1、细胞培养:无菌条件下获取整形手术切除的成人增生性瘢痕(病程为0.5～1年)及皮肤,采用组织块贴壁法培养成纤维细胞,传代。2、采用Western blot检测皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞内BMP-2的蛋白表达。3、采用RT-PCR检测皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞内BMP-2的mRNA表达。结果:1、Western blot结果发现,正常皮肤组织的BMP-2表达较少,而瘢痕组织中BMP-2的蛋白表达明显增多,结果具有统计学意义(P＜0.05)。2、RT-PCR结果显示正常皮肤组织的BMP-2的mRNA表达较少,而瘢痕组织中BMP-2的mRNA表达明显明显增多,结果具有统计学意义(P＜0.05)结论:增生性瘢痕成纤维细胞内BMP-2的mRNA、蛋白表达较正常皮肤明显增高。第三章BMP-2反义寡核苷酸对皮肤瘢痕组织中成纤维细胞生长活性及胶原合成的影响目的:观察反义寡核苷酸干扰BMP-2表达后培养的瘢痕成纤维细胞生长增殖、胶原合成的变化。方法:1、反义寡核苷酸及错义寡核苷酸的设计及合成根据人BMP-2的DNA序列,选择跨越起始密码子的-6～9位点作为靶位点,由碱基互补原则设计BMP-2反义寡核苷酸,错义寡核苷酸序列则为反义寡核甘酸序列碱基随意变动后经Blast比对,互补碱基数少于5个即可,正义寡核甘酸为DNA序列中随意的一段。BMP-2在GenBank接受号为NM 001200。经DNA合成仪合成后硫代修饰,高压液相色谱纯化。2、分组及细胞转染将培养的瘢痕成纤维细胞分为4组:A组(对照组)、细胞+培养液;B组、细胞+培养液+正义寡核苷酸;C组,细胞+培养液+错义寡核苷酸;D组、细胞+培养液+反义寡核苷酸。将各寡核苷酸与脂质体的混合物分别加入对应组转染成纤维细胞。3、测定各组BMP-2的表达采用Western blot方法检测各组BMP-2的表达。4、检测成纤维细胞生长抑制率:采用MTT分析法测定各组成纤维细胞的生长抑制率。5、检测BMP-2对成纤维细胞功能的影响:采用羟脯氨酸(hydroxypline,HP)比色法测定四组细胞胶原合成情况;采用RT-PCR测定四组细胞内I型胶原rnRNA表达情况。结果:1、反义寡核苷酸可抑制BMP-2的表达Western blot结果显示正义寡核苷酸(sODN)与错义寡核苷酸(mODN)对BMP-2的表达无明显影响,而反义寡核苷酸(asODN1,asODN2)均有不同程度抑制BMP-2的表达,特别是asODN2对BMP-2表达的抑制率达80%。2、BMP-2反义寡核苷酸抑制成纤维细胞的增殖MTT分析显示在不同时间点B组及C组与A组(对照组)的细胞生长率无显著性差别,而BMP-2反义寡核苷酸(asODN2)可抑制成纤维细胞生长、增殖(P＜0.05)。3、BMP-2反义寡核苷酸抑制成纤维细胞的胶原合成采用羟脯氨酸(hydroxypline,HP)比色法分析结果发现,BMP-2反义寡核苷酸降低成纤维细胞内BMP-2的表达,可抑制细胞中胶原的生成,而BMP-2正义寡核苷酸组及BMP-2错义寡核苷酸组,细胞中胶原的合成与对照组无明显变化。4、BMP-2反义寡核苷酸可抑制细胞中I型胶原的合成RT-PCR测定四组细胞内I型胶原mRNA表达情况显示BMP-2反义寡核苷酸可抑制细胞中I型胶原的合成,而BMP-2正义寡核苷酸组及BMP-2错义寡核苷酸组,细胞中I型胶原的合成与对照组无明显变化。结论:通过反义寡核苷酸干扰BMP-2的mRNA表达,阻碍BMP-2的蛋白表达,可抑制成纤维细胞的生长、增殖。可减少成纤维细胞内胶原的合成,I型胶原的mRNA表达减少。BMP-2具有促进成纤维细胞生长、增殖及胶原合的功能。