产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）作为甘油高效工业化生产菌株,拥有独特的耐高渗透压、耐高温高糖、耐有机酸等抗逆性强特点,是潜在的合成生物学底盘工业微生物。该菌株在遗传与分子生物学方面研究仍有许多空白,阻碍了对其工业应用潜力的开发。酵母作为外源基因表达的重要真核表达系统之一,影响基因表达的因素有很多。本研究从密码子偏好性、启动子、mRNA二级结构等对外源基因在该菌株中表达策略进行研究,旨在为工业抗逆酵母改造、生产高附加值产品提供基础,本论文研究具体如下:为从密码子偏好性优化外源基因表达,研究利用Codon-W分析C.glycerinogenes密码子使用情况,结果发现,C.glycerinogenes平均GC含量为40.3%,GC3s平均含量为37.2%,最优密码子有25个且多以A/U结尾;通过表达不同来源外源基因GFP、ldhA、xylB、xylD、kivD发现:GFP、ldhA密码子偏好与宿主相似,易于成功表达,而xylB、xylD、kivD的GC含量均大于65%,密码子多以G/C结尾,CAI值均约为0.2,ENc值都在40以上,基因只转录不表达,只有在密码子优化后才成功表达;结果表明,利用密码子同义突变优化外源基因,减小GC含量和ENc值,提高CAI值,能够调控基因在C.glycerinogenes中的表达效率。基于启动子表达策略,进一步研究不同启动子对GFP、xylB和ldhA表达影响,具体为:从C.glycerinogenes中选择5个组成型启动子PGAP、PPDC、PPGK1、PCS1和PLSC2表达GFP,PGAP启动强度最强,其次为PPDC和PPGK1;利用低pH诱导型启动子PGMT1、PGUK1和组成型启动子PGAP、PPDC、PPGK1表达xylB和ldhA,发现组成型启动子调控表达基因在pH 5.0和4.0时无明显变化,pH 3.0时明显下降,低pH诱导型启动子PGMT1表达的xylB和ldhA转录水平pH 2.5相比pH 5.5分别提高14.3倍和23.3倍,导致木糖酸和乳酸产量分别提高2.6倍和3.2倍;研究显示,C.glycerinogenes作为宿主可对不同外源基因采用不同启动子表达策略,可实现外源基因进行表达量控制。以GFP和密码子优化后xylB为研究对象,探索在C.glycerinogenes中翻译起始区附近二级结构最小自由能变化和拷贝数的表达策略,研究发现,GFP翻译起始区二级结构ΔG₀=-3.3 Kcal·mol^-1降至ΔG₁₂=-12.0 Kcal·mol^-1时荧光强度降低49.6%,而ΔG₄=-6.3Kcal·mol^-1的碱基配对概率相比ΔG₀减小,荧光强度提高31.1%;xylB翻译起始区二级结构ΔG₀=-6.2 Kcal·mol^-1升至ΔG₁=-2.4 Kcal·mol^-1时,减弱了mRNA二级结构稳定性,碱基处于配对的概率减小,表达的酶活提高40.4%;增加外源基因拷贝数使重组菌C.g-6GFP荧光强度是单拷贝的3.9倍,C.g-4xylB01酶活和xylB转录水平分别是单拷贝的1.5倍和2.8倍,木糖酸的产量达到24.5 g·L^-1,而6个xylB拷贝数时酶活和转录水平相比4个时降低35.7%和36.5%;结果表明,通过改变外源基因翻译起始区二级结构的最小自由能和优化拷贝数在一定程度上可以控制外源基因在C.glycerinogenes中的表达量。