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背景与目的:尽早诊断、准确分期和肝功能分级是提高肝癌疗效和改善预后的关键,但其完成需要完善的临床、实验室、影像学和病理资料,探索集肝癌诊断、分期和肝功能分级于一体的“一站式”诊断新技术有重要意义。前期我们筛选到365个肝癌血清适配子,创建了适配子三重血清荧光高通量测定技术,发现适配子三重血清荧光联合建模对肝癌有良好的诊断价值和一定的分期及肝功能分级价值,提示高通量检测一组诊断价值互补的适配子的三重血清荧光并建立诊断模型,可能实现肝癌“一站式”诊断。为此,本研究将优选前期筛选到的适配子构建适配子组,高通量检测适配子组三重血清荧光,创建肝癌“一站式”诊断新技术,并评价其诊断价值。方法:1、收集血清标本:收集2015～2018年间在南昌大学第一附属医院住院的治疗前的原发性肝癌、肝硬化、慢性肝炎患者的血清标本及其相关临床及实验室资料,并同期收集检查结果未见异常的健康体检者的血清标本。2、理论分析筛选代表性肝癌血清适配子:用RNA Structure 4.6软件分析前期筛到的365个肝癌血清适配子的二级结构。用Clustal X软件分析各适配子的序列同源性。选择二级结构各异、序列同源性低的适配子作为代表性适配子进行人工合成。3、混合血清分析优选高特异性肝癌血清适配子:采用前期建立的基于荧光定量PCR仪单管序贯检测适配子三重血清荧光法,在优化实验条件的基础上,分析各代表性适配子与肝癌混合血清结合的特异性,优选出对肝癌血清高特异性的候选适配子。4、单样本血清标本分析优选构建肝癌“一站式”诊断的适配子组:在优化检测条件的基础上,采用三重血清荧光法检测上述高特异性候选适配子与肝癌和对照血清标本作用后的荧光变化,优选出对肝癌“一站式”诊断价值大的适配子用于建立诊断模型,进入模型的各适配子即构成肝癌“一站式”诊断适配子组。5、评价适配子组对肝癌“一站式”诊断的价值:分别收集分类血清样本和随机连续血清样本,以上述优化的肝癌“一站式”诊断适配子组中的各适配子分别检测上述血清标本的三重血清荧光。以荧光指标为变量,分别建立Logistic回归（LR）、判别分析（DA）、支持向量机（SVM）、决策树（DT）和神经网络（ANN）的5种机器学习模型,获取模型对标本的肝癌诊断结果,通过ROC曲线分析评价适配子组对肝癌的定性诊断价值,计算适配子组对肝癌BCLC和TNM分期肝癌的分期准确率,以及对Child-Pugh肝功能分级的准确率。结果:1、代表性适配子的优选结果:Sructure 4.6软件对前期筛选到的365个肝癌血清适配子的二级结构分析显示适配子的二级结构丰富;Clustal X软件对适配子进行序列同源性分析,基于序列同源性分布365个适配子可划分为55个家族。根据相关相关文献中关于适配子序列同源性与二级结构对适配子与标靶结合的亲和力、特异性的规律,从365个适配子中优选26个代表性适配子。2、高特异性肝癌血清适配子的优选结果:根据26个代表性肝癌血清适配子检测40例肝癌混合血清与肝硬化血清的三重血清荧光的强度变化差异,Ap-HCS-9-109、、Ap-HCS-9-90、、Ap-HCS-9-120、、Ap-HCS-9-22、、Ap-HCS-9-110、Ap-HCS-9-23和Ap-ANHC-8-1-5共7个适配子的荧光增长差异均可达10%及以上。优选此7个适配子为候选高特异性肝癌血清适配子。3、构建肝癌“一站式”诊断价适配子组的优选结果:根据上述7个候选高特异性适配子对32例单个肝癌和肝硬化血清标本的三重血清荧光的检测结果,Ap-HCS-9-120、Ap-HCS-9-90和Ap-HCS-9-23 区分肝癌与肝硬化的AUROC大于0.75,联合分析AUROC达0.8以上;Ap-HCS-9-120预测BCLC和TNM分期的准确率高于55%,Ap-HCS-9-90预测TNM分期和Child-Pugh分级准确率分别达55%和75%。综合分析,优选上述3个适配子构建肝癌“一站式”肝癌诊断的适配子组。4、适配子组对肝癌“一站式”诊断的价值评价:以适配子组的各适配子分别检测112例分类血清样本和288例随机血清样本的三重血清荧光指标建立了 5种机器学习分类模型,对于区分肝癌和对照AUROC在0.767～0.992,在BCLC分期、TNM分期和Child-Pugh分级的准确率40～100%。其中,联合分析多数AUROC可达0.9以上,DT模型在各种条件下区分能力均表现稳定（AUROC均达0.9以上）分期分级准确率多数达90%以上。结论:1、对前期筛选到的365个肝癌血清适配子进行了二级结构分析和序列同源性分析,优选出序列同源性低和二级结构丰富的代表性适配子,理论上存在潜在的适合构建肝癌“一站式”诊断适配子组的候选适配子。2、在分别优化检测条件的基础上,先后采用混合血清和单样本血清逐步测定优选适配子的三重血清荧光强度,发现适配子Ap-HCS-9-120、Ap-HCS-9-90和Ap-HCS-9-23在肝癌的诊断、分期和肝功能分级有较好的价值,并以此3个适配子构建适配子组,发现可以有效进行肝癌“一站式”诊断。3、用上述适配子组测定了不同血清样本系列的三重血清荧光强度,通过5种机器学习方法建立起系列诊断模型,发现各模型,特别是决策树模型,在不同样本体系中均有良好且相似的诊断价值,优于AFP。表明基于的三重血清荧光法的适配子组对肝癌“一站式”诊断具有良好的效果。