心肌和骨骼肌细胞内Ca²⁺的稳态对细胞运动、心肌肥厚、血管张力、神经元传递和肌肉收缩等多种功能起着重要作用。在心肌中,Ca²⁺在细胞外、细胞质和肌浆网之间的转运作用影响心肌的收缩和舒张。心肌细胞收缩的过程与钙诱导的钙释放（CICR）机制有关。动作电位激活L型钙通道二氢吡喃受体（DHPR）,引起少量钙流入细胞质。少量Ca²⁺的流入触发了大量的钙通过鱼尼丁受体（RyR）从肌浆网（SR）释放到细胞质。为了使肌肉舒张,需要将细胞质中的钙进行转运。这一过程主要是通过肌浆网上的ATP酶（SERCA）将Ca²⁺泵回肌浆网腔。因此,SERCA和RyR都是决定肌肉放松速度和随后肌肉收缩强度的关键。SERCA位于SR膜内,分子量为110 k Da。SERCA是一种Ca²⁺ATP酶,它在肌肉放松的过程中将Ca²⁺从细胞的胞浆转移到SR腔内,这一过程需要ATP水解提供能量。每水解一个ATP分子运输两个Ca²⁺。当两个Ca²⁺和一分子ATP结合到泵的胞质侧时,ATP释放一个磷酸基,释放的磷酸基与泵结合,诱导泵的构象发生变化,这种构象变化为两个Ca²⁺进入提供了路径。SERCA主要由三个结构域组成:形成催化位点的磷酸化（P）和核苷酸结合（N）结构域,以及参与主要构象变化的（A）结构域。在脊椎动物中,SERCA由三个基因编码（SERCA1-SERCA3）。它们分别主要在骨骼肌、心肌和骨骼肌、内皮细胞和上皮细胞中表达。SERCA1基因的选择性剪接产生SERCA1a和SERCA1b两种亚型。SERCA1a的C端氨基酸比SERCA1b少7个,它受单跨膜肽肌磷脂（SLN）的调控。SERCA3基因编码6个剪接变体（SERCA3a-f）,目前在蛋白水平上仅检测到SERCA3（a-c）。SERCA2基因可以被剪接产生四种变异（SERCA2a-d）,其中肌肉特异性亚型SERCA2a是心脏发育和功能的关键因素。在心肌细胞中,SERCA2a受单跨膜肽磷脂（PLN）调控。PLN是由52个氨基酸构成的膜蛋白,是肌浆网上SERCA的重要调控因子。它由三个不同的结构域组成:由氨基酸序列1-20构成的细胞质结构域Ⅰa,(该结构域含有两个磷酸化位点,Thr17为Ca²⁺/Ca M激酶（Ca MKII）磷酸化位点,Ser16为的蛋白激酶A（PKAc）磷酸化位点),由氨基酸序列21-30构成的细胞质结构域Ⅰb以及由31-52氨基酸构成的跨膜结构域。PLN以单体和五聚体两种形式存在。单体是活性状态,通过与SERCA结合抑制其活性,五聚体被认为是由单体PLN从SERCA释放后形成的非活性形式。这是目前较为公认的最被接受的PLN抑制SERCA的模型,其关键抑制作用主要取决于PLN的跨膜结构域。PLN对SERCA的抑制受Ca²⁺浓度和PLN磷酸化的调控。PLN与SERCA跨膜域的四个螺旋（TM2、TM4、TM6和TM9）形成的疏水性区域结合,其结合与Ca²⁺浓度相关。当SERCA处于无钙状态时（E2）,疏水区打开,PLN与之结合。而当SERCA处于钙结合态时（E1）,疏水区关闭,PLN不能与之结合。PLN对SERCA的抑制也受到磷酸化的影响。PLN上的Ser16,Thr17分别能够被PKAc以及Ca MKⅡ磷酸化。Ser16的磷酸化足以逆转对SERCA的抑制作用,但双位点磷酸化对SERCA的影响尚不清楚,这些位点的磷酸化是否独立发生仍然存在争议。已被证实的是,磷酸化首先在Ser16发生,随后β-肾上腺素引起的应激响应诱导Thr17位磷酸化的发生。有研究表明,磷酸化后PLN与SERCA解离,逆转了PLN对SERCA的抑制作用,但也有研究认为磷酸化后的PLN仍与SERCA相互作用。核磁共振研究表明,PLN被磷酸化后,胞质结构域由螺旋向无序构象转变。当PLN的胞质结构域呈螺旋状时,直接与细胞膜接触;而当其处于动态无序的形式时脱离细胞膜。不同浓度的Ca²⁺不影响PLN二级结构的转变,说明Ca²⁺浓度的变化和磷酸化是通过不同的机制调控SERCA和PLN之间的相互作用的。前期研究表明PLN上的突变,包括R9C,R9H,R9L,R14del与扩张型心肌病（DCM）和心力衰竭（HF）相关。然而,由于缺乏复合物的结构,PKA磷酸化调控野生型和突变型PLNs的分子机制尚不清楚。在论文的第一个项目中,我们解析了PKA分别与野生PLN、PLN R9C和PLN A11E结合的三个蛋白复合物晶体结构。研究发现,WT PLN采用了与之前发表的PKAc-PLN复合结构非常不同的构象。在我们的结构中,最小非对称单元（ASU）包含一个PKAc和一个PLN。PLN的N端与PKAc的相互作用包括PLN的Arg9与PKAcα螺旋的静电作用以及PLN的Ala11、Ile18分别与PKAc的Phe129,Phe187的疏水作用。而在之前的结构中,ASU中有两个PKAc和一个PLN。他们PLN的N端与来自同一ASU的另一个PKAc分子相互作用,呈现出扭曲的构象。然而,根据我们的分子筛色谱谱图,PKAc以单体形式被纯化。因此两分子PKAc与一个PLN的相互作用很可能不存在于溶液中,而仅仅是由于晶体的堆积。为了验证我们的结构模型,我们在PLN中引入了突变A11E,并解析了PKAc-PLN A11E的复合物结构。PLN11位氨基酸由Ala突变为Glu,Glu与PKAc Arg133的排斥作用致使PLN的N端远离PKAc,消除了PLN Ala11与PKAc Phe129和Arg133的疏水作用。由此证明,在我们的野生型晶体结构中,Ala11确实有助于PLN与PKAc的结合。此外,我们还解析了长久以来备受关注的DCM突变R9C与PKAc的复合物结构。在PKAc-PLN R9C结构中,ASU包含两个PKAc分子,每个PKAc包含一个PLN。PLN9位氨基酸由Arg突变为Cys,PLN Arg9与PKAcα螺旋之间的静电作用被破坏,致使二者间的相互作用减少。R9C还影响反应中心Ser16侧链的构象,使亚胺二磷酸腺苷（AMP-PNP）和Ser16的羟基之间的距离增加0.5?,这可能会影响磷酸化反应速度。结构对比显示突变造成底物识别关键相互作用的缺失,造成PLN与PKA的结合力的减弱。通过表面等离子体共振（SPR）、热稳定性实验和ADP-glow实验,我们分别测定了野生型和一系列疾病突变型PLN与PKA结合的亲和力、其复合物的热稳定性,以及PKA对于不同PLN底物的活性。实验结果显示疾病突变降低底物与PKA结合的亲和力,进而通过改变K_M值导致PLN磷酸化水平的降低。其中,R14作为PKA识别序列Arg-Arg-X-Ser/Thr的一部分,R14del突变对PKA活性的影响尤为显著。前期研究发现PLN的Ser16为PKA磷酸化位点,而Thr17为Cam KⅡ磷酸化位点,但两个磷酸化位点之间的相互调节关系尚不清楚。通过生物物理和酶活测定,我们发现Thr17的磷酸化会减弱PKA对Ser16的磷酸化,起到负调控作用。另一种调节蛋白（ALN）是最近发现的一种更为普遍的SERCA调节肽。我们表征了ALN作为PKA底物的活性,发现相对于PLN,PKA对ALN具有更低的活性。论文的第二个项目研究了昆虫钙离子通道鱼尼丁受体（RyR）的结构与功能。RyR是位于SR中的大型钙释放通道,介导钙从SR腔释放到细胞质。它在心肌细胞和骨骼肌细胞的兴奋-收缩偶联中起重要作用。是同源四聚体,分子量超过2.2MDa,是已知最大的离子通道。RyR每个亚单位有5000个氨基酸,其中位于细胞质的约4500个氨基酸,剩下小部分位于肌浆网内。RyR的开关与钙离子浓度密切相关,在微摩尔钙浓度下具有较高的打开概率,而在纳摩尔钙浓度下通道关闭,在毫摩尔钙浓度下通道受到抑制。RyR释放Ca²⁺受多种因素调控,包括Mg²⁺、ATP、咖啡因、毒素、药物等小分子;辅助蛋白,如FKBP12/12.6、钙调素、S100A1、sorcin;翻译后修饰,如磷酸化、氧化和硝化。哺乳动物RyR有三种亚型:RyR1、RyR2和RyR3,它们的序列同源性约为65%。这些亚型的表达表现为组织特异性,RyR1在骨骼肌中表达量较高,RyR2在心肌中表达量较高,而RyR3在不同组织中均有表达。在昆虫中只有一种RyR,在肌肉和中枢神经系统中表达。由于脊椎动物和无脊椎动物之间较低的保守性,昆虫RyR可作为选择性较高的商品杀虫剂的靶点。目前针对RyR的商品化杀虫剂主要有邻苯二甲酸和邻苯二胺。其中,以鳞翅目昆虫和鞘翅目昆虫RyR为靶点的二胺类杀虫剂是目前应用最为广泛的农药种类之一。氯安替尼洛、氟苯二胺和氰安替尼洛是目前市场上最主要的二胺类杀虫剂,每年的销售额超过20亿美元。尽管进行了广泛的研究,二胺类杀虫剂的分子作用机制仍不清楚。针对小菜蛾RyR穿膜区域的抗性突变G4946E和I4790M以及番茄潜叶虫Tuta absoluta中相关的突变位点G4903E和I4746M的研究表明,该区域可能与二胺类杀虫剂的结合有关。G4946E突变位于螺旋S4与S4-S5连接之间的铰链处,对通道的开关至关重要。根据同源模型,I4790M位于螺旋S2中,其位置接近G4946E。Kato等人研究了氟苯二胺与家蚕RyR的结合,确定了两个关键区域,一个在N端域附近,另一个在C端跨膜域。然而,抗性突变是否直接或变构性地影响RyR与二胺类杀虫剂的相互作用尚不清楚。目前已经报道了一些哺乳动物RyR的晶体结构。近年来,随着冷冻电镜（cryo-EM）的应用,比较完整的RyR结构信息例如兔骨骼肌的RyR1亚型和猪心脏RyR2亚型的高分辨电镜结构均被进行研究。然而,昆虫RyR的结构尚未报道,这阻碍了我们对这一重要杀虫靶点的生理功能以及杀虫效果和抗性突变的分子机制的了解。本文报道了世界上危害十字花科作物的害虫小菜娥（DBM）的N端结构域（NTD）的晶体结构。与哺乳动物RyR类似,DBM也显示出β-trefoil折叠构象。但与哺乳动物RyR相比,DBM RyR NTD有两个区域具有独特的结构特征,形成短发夹结构的β1-β2链以及采用不同构象的loop 4。结合DBM A的晶体结构,同源建模和分子动力学模拟,我们建立了DBM RyR ABC的结构模型。我们发现β1-β2链位于亚基间的AB界面,loop 4位于亚基内的AB界面。这些具有显著结构差异的界面形成了两个DBM特异性口袋,可以作为潜在的选择性较高的物种特异性杀虫剂靶点。有趣的是,β1-β2链和loop 4也是哺乳动物RyR疾病突变的热点区,这表明这一非保守区域对通道功能至关重要,并能在进化过程中耐受突变。无论如何,我们的结构将为开发基于虚拟筛选或基于计算机的合理设计的特定杀虫剂奠定基础。热稳定实验表明,DBM RyR NTD的稳定性高于哺乳动物RyR,这可能是由于晶体结构中存在稳定的二硫键所致。RyR1无二硫键,解链温度（T_m）值最低;RyR2二硫键不稳定,T_m值居中,DBM RyR二硫键最稳定,T_m值最高。Aracenaparks等人发现,哺乳动物RyR中二硫键的形成受细胞氧化还原环境的调控。因此,Tm的差异可能与昆虫细胞氧化还原调节系统的差异有关。以往的研究表明,DBM NTD是与杀虫剂氟苯二胺相互作用的两个关键区域之一。氟苯二胺作为第一个针对昆虫RyR的商用杀虫剂,已经被使用了十多年,但与RyR的确切结合位点仍不清楚。因此,我们采用等温滴定量热法测定了DBM NTD与氟苯二胺的结合能力。测得K_d为664 m M,比报道的氟苯二胺与微体膜结合的Kd（4.7 n M）低5个数量级。这可能是由于NTD的口袋是不完整的。之前的研究表明,RyR NTD的口袋是由178-285号氨基酸构成的,而我们的NTD结束于205号氨基酸。为了阐明氟苯二胺与RyR的结合机制,需要设计一个包含完整口袋的结构域进行近一步研究。