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新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)强毒株引起的一种具有高度传染性的烈性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为需报告疾病之一。NDV属于副黏病毒科(Paramyxoviridae),副黏病毒亚科(Paramyxovirinae),禽腮腺炎病毒属(Avuluvirus)的成员,是单股、负链、不分节段、有囊膜的RNA病毒。本研究对实验室前期构建的La Sota C5反向遗传平台进行了改造和优化,发现改造后的感染性克隆GLaSotaC5与LaSota序列完全一致;且其拯救效率有明显提高。在此基础上构建了 JS10 M/F/HN三个基因替换的重组病毒GLaSotaC5M/F/HN,并比较了其免疫原性。1.新城疫病毒La Sota C5株感染性克隆的改造与优化参照La Sota C5株的全基因序列,将基因组分成4段,经RT-PCR从La Sota C5株感染的尿囊液中扩增目的片段,分别连入克隆载体中;然后顺次克隆到pMD-20T载体中,构建含有La Sota C5基因组大部分片段的中间质粒T-ABCD。该质粒和前期构建的TVT-LT分别经BglⅡ酶切后回收大片段,最后连接为含有病毒全长cDNA的转录载体TVT-G La Sota C5。将三个辅助质粒与全长转录载体共转染能稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞。转染后72 h收集细胞,反复冻融三次后接种9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔。收集24 h后死亡鸡胚尿囊液,按OIE标准测其血凝(HA)效价,并用RT-PCR方法和基因测序鉴定是否为拯救病毒。结果显示第一代尿囊液HA效价为28,传代三次后,HA滴度上升为211。序列测定表明拯救病毒带有引入的遗传标记,证明成功拯救出了具有感染性的GLa Sota C5株新城疫病毒。La Sota C5株反向遗传操作平台的建立为后续研究新城疫弱毒各结构基因功能、开发新型新城疫病毒疫苗等的研究奠定了基础。2.嵌合新城疫Class Ⅰ/Class Ⅱ弱毒疫苗候选株的构建RT-PCR方法分别扩增出JS10株的M,F和HN基因,T-A克隆测序后经PCR定点诱变连续缺失两个酶切位点,再通过定向克隆构建成中间质粒至T-AB2中;使用两端的Pac Ⅰ和ASC Ⅰ单酶切位点将JS10株的M,F和HN基因整体与TVT-GLa Sota C5的相应片段替换,从而构建成三基因替换的重组转录载体TVT-GLa Sota C5M/F/HN。随后将TVT-GLa Sota C5M/F/HN 与 3 个辅助质粒pCI-L、pCI-NP 和 pCI-P共转染BSR-T7/5 细胞,成功拯救出致弱的病毒GLaSotaC5M/F/HN,其血凝价210、鸡胚半数感染量(EID50)为1010.2EID50/ml、鸡胚最小致死剂量平均死亡时间(MDT)大于120h、脑内接种致病指数(ICPI)为0.22、静脉接种致病指数(IVPI)为0。经SPF鸡胚连续传12代后未发现生物学特性改变。上述结果表明拯救的病毒毒力已明显致弱、血凝价明显升高、遗传稳定性良好,是一个较为理想的疫苗候选株。3.嵌合新城疫Class Ⅰ/Class Ⅱ弱毒疫苗候选株的免疫原性评价为了比较GLa Sota C5M/F/HN与常用疫苗株La Sota的免疫原性差异,我们首先制备了 GLa Sota C5M/F/HN和La Sota的高免血清并对不同基因型的NDV毒株对进行交叉血凝抑制试验。比较后发现,GLa Sota C5M/F/HN的抗血清对受试的强毒株的HI效价均高于LaSota的抗血清。随后选取了 5株强毒与两种血清分别进行细胞交叉中和试验、鸡胚交叉中和试验,结果显示GLa Sota C5M/F/HN的抗血清对所有强毒株的中和效价均比La Sota抗血清高3-5倍,对Class Ⅰ强毒9a5b的中和效价是La Sota的10倍。最后我们将GLa Sota C5M/F/HN和La Sota分别免疫SPF鸡,然后用Class Ⅱ基因Ⅶ型强毒株ZJ1攻毒,Ⅸ强毒F48和Class Ⅰ强毒9a5b攻毒比较两者的免疫效果。结果显示上述两者均能提供100%的保护,但GLa Sota C5M/F/HN能显著降低免疫鸡群攻毒后的排毒率。上述试验表明,GLa Sota C5M/F/HN有望成为新的弱毒疫苗候选株。4.嵌合新城疫Class Ⅰ/Class Ⅱ弱毒疫苗候选株的黏膜免疫水平评价选取60只SPF雏鸡,随机分为A、B、C 3组,每组20只。A组和B组分别于7日龄时以滴鼻点眼方式免疫GLa Sota C5M/F/H/和La和La Sota,免疫剂量均为106 EID50,C组为不接种病毒对照组。在免疫后第1d、4d、7d、14d,每组抽取5只鸡,处死后采集各种黏膜洗脱液,间接ELISA检测其IgM,IgG和SIgA抗体水平。研究结果表明:两株病毒免疫7日龄雏鸡后均可引起机体的局部黏膜免疫应答,且GLa Sota C5M/F/HN所诱导的黏膜免疫水平略高于La Sota。对免疫球蛋白亚类检测表明,系统性免疫应答主要以IgG抗体为主,而局部黏膜免疫应答则以SIgA抗体为主。