大肠杆菌Nissle 1917是由德国科学家Alfred Nissle于1917年发现的一种益生菌,其血清型为O6:K5:H1,它可以在肠道定植,维持肠道菌群平衡,刺激肠道免疫组织产生免疫球蛋白和细胞因子,对肠道粘膜免疫具有重要的作用。在国外Nissle1917已批准临床应用于人,小鼠和牛,由于对猪的益生作用还需进一步的验证,因此临床尚未应用。目前国内还没有此方面的任何报道。细菌载体疫苗是将编码靶抗原或病原体特异性抗原的DNA片段插入减毒病原菌或者共生菌,并在其中有效表达和向体内免疫系统提呈表达的抗原,有效激发机体的免疫应答,以期达到预防一种或多种疾病的作用。由于作为载体菌的减毒病原菌存在一定的毒力返强风险,益生菌作为蛋白或抗原的释放载体成为新的研究亮点。随着益生菌载体菌蛋白表达技术的成熟,大肠杆菌Nissle 1917作为口服疫苗安全活菌载体具有广阔的应用前景。本实验旨在证实大肠杆菌Nissle 1917株作为肠道共生菌存在于猪体内,并从猪体内分离鉴定出此菌,通过绿色荧光蛋白探索猪源Nissle 1917在小鼠体内的定植,并检测经小鼠口服菌体表面表达粘附素fedF的重组菌Nissle 1917-fedF后的免疫应答相关参数。Gabriele等依据人源性大肠杆菌Nissle 1917的I型菌毛亚单位fimA、F1C菌毛亚单位focA和两个质粒pMUT1﹑ pMUT2的基因序列设计出5对特异性的PCR引物用于检测人源性大肠杆菌Nissle 1917,Kleta等用这五对PCR引物同样能够从猪肠道粪便制备的DNA样品中检测到Nissle 1917。本试验是以实验室保存的人源大肠杆菌Nissle 1917为阳性参考菌株,采集不同品种、不同日龄健康断奶仔猪的新鲜粪便制备的DNA135份,用上述5对引物对DNA样品进行PCR扩增,结果显示从其中的两份DNA样品中扩增出与上述五对PCR引物预期大小相符的5个特异性目的片段,初步认为该两份样品存在猪源大肠杆菌Nissle 1917。基于上述阳性假设,将扩增的427bp大小的pMUT2(a)目的片段,经PCR产物纯化,T载体连接、克隆、重组质粒DNA大量扩增,纯化回收pMUT2目的片段,用非同位素地高辛随机引物标记法制成DNA探针,该探针特异性高,敏感度达16pg。通过菌落原位杂交的方法从上述两份阳性粪便样品中分别筛选出2株阳性菌落,最后通过血清学检验、PCR扩增和目的片段的克隆测序进一步鉴定为阳性菌株。构建表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组菌猪源Nissle 1917-GFP和表达F18ab亚单位fedF的重组菌Nissle 1917-fedF,重组菌Nissle 1917-GFP在紫外灯下可发出绿色荧光,而Nissle 1917-fedF在厌氧条件下诱导培养可在菌体表面表达大肠杆菌黏附素F18的亚单位fedF。经多次口服免疫ICR小鼠,检测重组菌在小鼠体内肠道的定植时间和外周血液样本中抗fedF特异性IgG水平。检测结果显示Nissle 1917-fedF比Nissle 1917-GFP在小鼠肠道内的存留时间长24h。Nissle 1917-FedF组在初免后14天产生了抗fedF的IgG抗体,第33天的抗体水平明显升高。而Nissle1917和Nissle 1917-GFP组均未检测到抗fedF的IgG抗体。本实验为Nissle 1917载体菌口服疫苗的研制和仔猪腹泻病的防治提供新的可能途径和奠定一定的研究基础。