中脑多巴胺(Dopamine,DA)能神经元参与躯体运动、情绪及动机等重要功能的调节,是脑内多巴胺系统中功能最为多样的细胞群之一。在神经发育过程中,中脑腹侧的DA神经元分别与纹状体、边缘系统和皮质建立了不同的多巴胺神经通路。当这些神经通路受损或功能失调时,将导致帕金森病、精神分裂症、药物成瘾等多种神经和精神源性疾病。这些疾病虽都与中脑DA神经元相关,但其发病机制、结构基础、病理改变等多个方面仍存在较大差异。因此,明确中脑DA神经元的多样性,将对我们进一步研究上述疾病的发病机制及针对性治疗具有重要意义。中脑DA神经元主要位于腹侧被盖区(Ventral tegmental area,VTA,A10)和黑质区(Substantia nigra,SN,A9),依据解剖学定位将中脑DA神经元划分为SN区DA神经元和VTA区DA神经元,这种划分方法在探究其神经环路、分子表达、功能差异的研究中得到了广泛的应用。然而近年来,通过荧光微球、病毒感染、光遗传学等新型技术,使我们对中脑DA神经元有了新的认识。多项研究均显示VTA和SN区DA神经元在分子表达谱及功能上存在异质性。此外,明确多巴胺能神经元电生理活动的规律,对于理解其在运动、动机以及奖赏行为中的作用也至关重要。研究报道表明,SN和VTA区DA神经元在动作电位发放频率、超极化激活的G蛋白偶联内向整流钾离子通道、三磷酸腺苷敏感钾通道等电生理学特性有差异。综上,目前的研究将我们对中脑DA神经元的认识上升到了亚群的水平,但对其描述都单一的依赖于形态、生化、分子表达谱或电生理特性,需要更为系统深入的探究,全面的描述脑DA神经元亚群的生理特性,是理解单亚群DA神经元受累相关疾病的理论基础。为了对中脑DA神经元亚群进行更为系统的分析,我们依据功能异质性及神经解剖特征对其三条上行投射通路进行了细化,并设计了如下实验:1.通过荧光示踪剂脑内注射标记DA神经元亚群。C57B16小鼠作为研究对象,根据神经环路参与功能的异质性选取注射点,细化神经通路的划分。以脑立体定位仪作引导,将荧光示踪剂分别注射至前额叶皮质、边缘前皮质,伏隔核核部、壳部内侧区、壳部外侧区,以及纹状体喙侧、尾部腹侧区、尾部背侧区。2.术后48小时,对实验鼠灌注固定后取脑,行冰冻切片,留取注射脑区及相应中脑部位切片。选取注射脑区切片,应用全景数字扫描显微镜观察注射靶点,并对脑片进行全景重建明确注射脑区的准确性。3.将注射脑区相应的中脑切片进行酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)染色,并观察对应注射靶点中脑内标记DA神经元亚群的分布,细化并量化标记神经元在VTA和SN亚区的分布比例,明确不同神经通路DA神经元亚群的分布特征;通过激光共聚焦显微镜重建标记神经元,观察其胞体形态并测算大小,分析不同DA神经元亚群的形态学差异,明确基于神经投射通路的中脑DA神经元亚群的定位及形态特征。4.注射逆行示踪剂的小鼠麻醉后冰上取脑,行振动切片制备300μm中脑组织切片。孵育完成后,在红外相差显微镜下选取并封接标记神经元,采用脑片钳技术检测不同DA神经元亚群的电活动:I-clamp“Gap-free”模式下记录神经元亚群的自发放电频率及幅度;“Episodic stimulation”模式下给予步阶刺激,记录DA神经元亚群的诱发放电频率及幅度。5.除分析自发放电及诱发放电特征外,本实验引入一阶时间导数及相位分析,从毫秒级水平上辨别其发放过程中特定时间或膜电位对应的瞬时电流,更为精确的分析神经元亚群之间动作电位发放过程中动态的差异。经上述实验,结果显示:1.将示踪剂注射至不同的脑区后,可在中脑观察到标记的神经元,经TH免疫荧光染色显示,逆行示踪剂标记神经元呈TH阳性。其中,参与中脑-皮质投射通路的中脑DA神经元定位于mVTA,向边缘前皮质区的投射更为密集。投射至NAc核的DA神经元均匀的分布于mVTA和dlVTA,投射至NAc内侧壳的DA神经元主要定位于mVTA,而支配NAc外侧壳的DA神经元主要来自dlVTA。黑质-纹状体投射通路中,mSNc的DA神经元密集的投射至aCPu;投射至pdCPu的DA神经元主要定位于mSNc和dSNc;投射至pvCPu的DA神经元主要定位于dSNc,少量定位于dIVTA。2.各亚群DA神经元在中脑混杂存在,突破了解剖学区域的划分,但仍存在一定规律:分布于mVTA的DA神经元主要投射至NAc核及NAc内侧壳,在dlVTA的DA神经元主要投射至NAc外侧壳,位于mSNc的DA神经元60.32%投射至纹状体喙侧,定位于dSNc的DA神经元主要投射至纹状体尾背侧及尾腹侧;分布在ISNc的DA神经元主要投射至纹状体尾背侧。3.自发放电检测显示,中脑-边缘系统投射通路第二类DA神经元基础兴奋性强于其他亚群,其次为黑质-纹状体投射通路第二类DA神经元亚群,而中脑-皮质投射通路、中脑-边缘系统投射通路第一类和黑质-纹状体投射通路第一类DA神经元自发放电频率低,基础兴奋性较弱。综合上述结果可知,定位于中脑腹侧区的DA神经元基础兴奋性弱于背侧区。4.-100pA方波刺激,中脑-边缘系统投射通路第二类DA神经元和黑质-纹状体投射通路的DA神经元均可产超级化激活电位变化,尤其以黑质-纹状体投射通路第二类DA神经元产生的超极化电位最大。50-100pA步阶电流刺激,中脑-皮质通路、中脑-边缘通路DA神经亚群在放电频率上无区别,而动作电位幅度存在明显差异,可以以此区分。黑质-纹状体通路的DA神经元亚群与上述三个亚群放电频率及幅度均存在明显差异。其中,黑质-纹状体通路第二类DA神经元亚群对施加的刺激反应最为明显,在100pA电流刺激下,动作电位的发放直接被阻断。5.动作电位一阶时间导数及相位分析表明,在AP发放过程中,中脑-边缘神经通路第一类DA神经元亚群膜通透性最高,其次分别为黑质-纹状体通路第一类DA神经元亚群,中脑-边缘神经通路第二类DA神经元亚群,定位于mVTA的中脑-皮质通路DA神经元亚群,膜通透性最低的为黑质-纹状体通路第二类DA神经元亚群。综上,本课题通过神经逆行示踪技术标记了中脑DA神经元亚群,细化并明确了其在中脑的定位,进行了形态差异分析,进一步结合自发、诱发放电特征及动作电位的一阶时间导数、相位分析,得出以下结论:1)中脑内投射至PFC,NAc和CPu的DA神经元亚群以特定的规律在VTA和SN混杂分布,突破了传统的解剖区域界线;亚群神经元在自发放电和诱发放电及AP发放过程中膜电位通透性的动态变化上有明显区别;2)依据神经解剖、形态及电生理特性,可将中脑DA神经元分为以下亚群:中脑-皮质通路DA神经元亚群;中脑-边缘通路第一类DA神经元亚群;中脑-边缘通路第二类DA神经元亚群;黑质-纹状体通路第一类DA神经元亚群;黑质-纹状体通路第二类DA神经元亚群。本实验明确了中脑DA神经元亚群的异质性,为深入理解和探究相关疾病的发病机制及针对性治疗提供依据。