目的：　　 分别以临床粪便标本中已知肠道病毒和含漱液标本中已知呼吸道病毒为假设未知RNA病毒，在随机PCR技术的基础上，通过对标本前处理方法的改进，探索一种不依赖于病毒培养，直接对临床标本中未知RNA病毒作出鉴定的分子生物学方法。　　 方法：　　 1、临床标本的前处理：首先对临床标本进行前处理，包括反复冻融、低温离心、微孔膜过滤、聚乙二醇浓缩，以及核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的处理。通过对临床标本前处理方法的改进与优化，尽可能地去除标本中的无关核酸，以增大病毒核酸在标本中所占的比例，提高阳性检出率。　　 (1)将临床粪便和含漱液标本反复冻融3次后，3000r/min离心10min，使包裹于细胞中的病毒充分释放，以提高标本中病毒含量。　　 (2)经0.22μm滤膜过滤，去除细胞碎片、杂质和细菌等颗粒物质。　　 (3)在滤液中加入10％的聚乙二醇6000，用以浓缩病毒液。37℃孵育1h后，于4℃过夜。次日12000r/min4℃离心30min，沉淀用200μl焦碳酸二乙酯水悬浮。　　 (4)在200μl悬浮液中加入15μ,1200μg/ml的核糖核酸酶A，37℃温浴2h，以除去标本液中游离的RNA。　　 (5)核糖核酸酶处理之后立即提取病毒RNA,在RNA提取液中加入脱氧核糖核酸酶，37℃温浴30min，以去除RNA中的DNA污染物。　　 2、病毒RNA的提取、逆转录与随机PCR扩增：对经前处理后的临床标本提取病毒RNA，在反转录酶的作用下，以锚定随机引物合成第一链互补cDNA，在KlenowDNA聚合酶的作用下，合成双链cDNA。用cDNA作模板，以锚定特异性引物进行PCR扩增。　　 3、扩增产物回收纯化与克隆：根据Marker的位置切取300～1500bp区域的凝胶条，回收纯化PCR产物，将纯化的目的片段与pGEM-Teasy载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据蓝白斑筛选原理，随机挑取若干分离良好的白斑，增菌培养。以菌液为模板进行PCR扩增，验证载体中有无插入片段。　　 4、测序及比对：将获得的阳性克隆进行DNA序列测定。获得的测序结果在NCBI上进行BLAST在线比对，根据同源性确定核酸片段的来源，并最终实现对未知病毒的鉴定。　　 5、不明病原的临床标本验证：采用本研究所建立的方法对6份具有疑似流感症状但流感病毒检测呈阴性的咽拭子标本进行未知病毒鉴定，用以对方法的实用性与临床效果加以验证，同时也以期查明该时期除流感病毒外，引起患儿流感样症状的主要病原体。　　 结果：　　 1、粪便标本阳性克隆的插入序列经BLAST比对后结果：粪便标本的所获得8个克隆中有6个克隆与人肠道致细胞病变孤儿病毒（简称埃可病毒）14型同源性最高，达95％～99％；其余2个克隆与细菌同源性很高。本研究从病毒载量为1.0×106Cope/ml的粪便标本中，以75％的病毒阳性克隆率的检出了标本中的肠道病毒。　　 2、含漱液标本阳性克隆的插入序列经BLAST比对后结果：含漱液标本10个阳性克隆中，有7个与甲3亚型流感病毒(H3N2)同源性最高(99％～100％)，其余3个为细菌和人基因组DNA。本研究通过对标本前处理方法的改进，从病毒载量为4.8×103Cope/ml的含漱液标本中，以70％的病毒阳性克隆率检测出标本中的甲3亚型流感病毒病毒。　　 3、临床标本验证结果：对6份具有疑似流感症状但流感病毒检测呈阴性的咽拭子标本检测后发现，除1份标本无阳性结果外，其他5份中有1份标本病毒阳性克隆的插入序列与基因库公布的人肠道致细胞病变孤儿病毒9型同源性最高(96％～99％)；另外4份标本病毒阳性克隆的插入序列与柯萨奇病毒A组4型同源性最高(97％～100％)。　　 结论：　　 本研究成功建立了一种基于随机PCR的未知RNA病毒的检测方法，其优点在于不依赖病毒的细胞培养及其核酸序列信息，并且能极大地提高对RNA病毒鉴定的阳性率，这种方法的建立为检测不明原因疾病和新发传染病病原体提供了新的思路，这将在不明原因疾病和传染病病原体的鉴别诊断中，发挥十分重要的作用。