目的:在司法实践中,经常遇到在交通事故、绑架、刑讯逼供等案件中发生非致命性损伤经历一段时间后发生多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)甚至死亡的情况。但是由于损伤程度不足以危及生命,常常由于死亡原因不确定或有争议,导致案件久拖不决。因此,研究此类损伤对机体重要生命器官形态和机能的影响对于揭示损伤导致死亡的确切机制具有重要意义。机体在受损伤后为适应或保护机体,会出现应激反应。应激时机体的神经内分泌反应主要表现为蓝斑-交感-肾上腺髓质系统(Locus ceruleus-norepinephrine system,LC/NE)和下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统(Hypothalamus-pituitary-adrenal cortex system,HPA)兴奋,血中儿茶酚胺(catecholamine,CA)浓度迅速升高,伴随一系列功能代谢改变,具有重要的防御代偿意义。但是如果应激原过于强烈或持久,则会导致机体的功能异常、代谢障碍及组织损伤。上述机械性损伤本身是一种应激原;此外当事人遭受损伤后产生的焦虑、紧张或抑郁等不良情绪,也可作为应激原引起机体心理应激。束缚应激是公认的复制心理精神应激的动物模型,本实验室前期研究发现,束缚应激可以加重挤压伤大鼠心脏、肝脏及肾脏损伤,导致MODS,表明强烈的心理应激反应可能在非致命性机械性损伤导致死亡的过程中发挥重要作用。孤束核(nucleus tractus solitarius,NTS)为延髓背侧核团之一,存在较多的儿茶酚胺能神经元和纤维终末,既参与应激反应调控,也是心血管反射的调节中枢之一。研究证实,损毁大鼠孤束核神经元可以减弱压力感受器反射、引起心律失常甚至猝死。因此,孤束核在维持心血管系统稳态方面发挥重要作用。心血管系统功能障碍是司法实践中常见的死亡机制之一,那么应激是否引起孤束核损伤,这是否参与了非致命性机械性损伤导致死亡的机制,目前均未见文献报道。挤压伤模型是公认的复制肢体软组织挫伤的动物模型,为模拟实际案情,明确应激性损伤机制,本实验将建立束缚应激加挤压伤的复合模型,探讨心理应激和躯体应激双重应激原刺激对大鼠孤束核的影响,为揭示非致命性机械性损伤导致死亡的机制提供实验依据。方法:1健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,体重220~240g,于控制条件下适应性喂养一周后,随机分为四组(每组24只)。①对照组(Con):大鼠于固定时间禁食水(每日8h或10h或12h交替进行)。②束缚应激组(Rs):大鼠于固定时间放入束缚应激模具内进行束缚,同时禁食水(每日8h或10h或12h交替进行)。③挤压伤组(CI):大鼠用无水乙醚麻醉后,于双后肢上压24kg重物,连续挤压6小时,此后不再进行挤压,每日相应时间禁食水。④复合模型组(Com):大鼠连续挤压6小时,于当日晚开始进行束缚(每日8h或10h或12h交替进行)。通过体重记录,以评估是否成功建立束缚应激模型。通过观察大鼠挤压后局部表现、活动状态等证明挤压伤模型是否建立成功。各组每天上午固定时间经BP-98A无创血压计测量血压。造模21天后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,腹主动脉取血、离心、取上清,用于检测儿茶酚胺浓度。于冰上迅速取出大脑放入10%的多聚甲醛溶液中固定。脑组织经固定制作石蜡切片,进行硫堇染色观察组织病理学改变,同时应用免疫组织化学染色(IHC)方法观察酪氨酸羟化酶(TH)、胶质细胞源性纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和凋亡执行者Caspase-3蛋白表达的变化。2数据以“均数±标准差(Mean±SD)”表示,用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),用最小显著差法(least significant difference,LSD)或Tamhane’s作两两比较,以P<0.05为有显著统计学差异。结果:1体重测量结果对照组体重逐渐增加,束缚应激组体重与对照组相比增长缓慢,P<0.001。表明束缚应激模型成功建立。2血浆中NE、E的浓度变化挤压伤组NE、E浓度与对照组相比无统计学差异。与挤压伤组相比,束缚应激组和复合模型组血浆中NE、E浓度均明显升高,P<0.001。3酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学检测结果对照组孤束核TH有少量表达。与对照组相比,其他各组TH表达水平均明显升高。其中与挤压伤组相比,复合模型组TH阳性细胞数目明显增多,P<0.001。TH蛋白表达检测结果和血浆儿茶酚胺浓度检测结果表明,与单纯挤压相比,双重应激原刺激确实可以引起机体更高强度的应激反应。4硫堇染色结果对照组孤束核神经元中尼氏体分布均匀;挤压伤组孤束核可见尼氏体消失或位置发生变化,神经元出现不同程度水肿、变形;束缚应激组可见少数神经元出现固缩、坏死等病理改变;与挤压伤组相比,复合模型组孤束核内可见部分神经元尼氏体分布不均、消失,多数神经元变形、固缩,深染。5 Caspase-3蛋白免疫组织化学检测结果硫堇染色发现神经元有固缩、坏死现象,本研究进一步检测了凋亡执行蛋白Caspase-3的表达。对照组Caspase-3蛋白有少量表达,其他各组Caspase-3蛋白表达均增多。其中与挤压伤组相比,复合模型组Caspase-3阳性细胞数目明显增加,P<0.001。结合硫堇染色结果、GFAP和Caspase-3蛋白表达水平变化,本研究认为束缚应激加重挤压伤大鼠孤束核的损伤,促进神经元凋亡。6星形胶质细胞(GFAP)免疫组织化学检测结果GFAP是星形胶质细胞特异性标志物。中枢神经系统发生损伤时,星形胶质细胞激活,GFAP表达增强。对照组GFAP蛋白有少量表达,其他各组GFAP表达均增多。其中与挤压伤组相比,复合模型组GFAP阳性细胞数目明显增多,突起增多变长,P<0.001。7血压测量结果血压波动幅度增大是孤束核损伤的标志之一。对照组血压波动较小,总体趋势平稳。与对照组相比,挤压伤组血压于挤压第二天出现明显下降,随挤压后时间延长逐渐升高,于第14天后血压变化与对照组相比无统计学差异。束缚应激组血压出现较大幅度波动,与对照组相比具有统计学差异。与挤压伤组相比,复合模型组血压波动幅度显著升高,变异程度增大,P<0.001。结论:本研究成功建立了大鼠挤压伤和束缚应激的复合模型,通过观察孤束核组织病理学改变、检测血压变异程度、血浆中CA浓度以及孤束核内TH、GFAP和Casepase-3蛋白的表达水平,从形态和功能两方面证实了束缚应激加重挤压伤大鼠孤束核神经元的损伤。