在蛋白质组学研究中，对蛋白质或肽段混合样品的充分分离是提高蛋白鉴定灵敏度的关键。多维液相色谱（multi-dimensional liquid chromatography, MDLC）分离技术结合了各种不同原理的色谱分离类型，极大地提高了分离系统的峰容量，能满足高效、高可重现、高自动化分离复杂蛋白质组学样品的要求。应用最为广泛的多维液相色谱分离技术是由离子交换色谱（ion-exchangechromatography, IEC）和反相色谱（reversed-phase chromatography,vRPC）串联的二维液相色谱分离方法。近年来，由于蛋白质组学样品鉴定深度要求的不断提高，在二维液相色谱分离方法的基础上，通过对样品进行预分离的方式发展出了分离能力更强的三维液相色谱分离方法，并且已经展现出了有效简化复杂样品的潜力。本文在传统的二维液相色谱-质谱联用方法的基础上，分别采用肽段水平样品预分离和蛋白水平样品预分离，建立了两种三维液相色谱-质谱联用分析方法。小鼠乳腺癌细胞系4T1细胞裂解液作为复杂蛋白质组学样品的实例，在其中进行了分离和检测。在基于肽段预分离的三维液相色谱分离系统下，鉴定到的蛋白数目是传统二维液相色谱分离系统中鉴定到的2倍，表明分离系统维度的提高使复杂样品进一步简化，有助于蛋白鉴定能力的提高；而在基于蛋白预分离的三维液相色谱分离系统下，蛋白鉴定的效率更高，鉴定到的蛋白数目是传统二维液相色谱分离系统中鉴定到的2.4倍，并且高丰度蛋白的富集程度更高，表明在蛋白水平进行样品预分离能够更有效地分离和富集蛋白，更加适用于高度复杂的蛋白质组学样品的鉴定。