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背景膝骨关节炎已成为致残性非常高的一大慢性退行性疾病,运用中医药防治本病的发生发展是保障人类健康的重大需求。膝骨关节炎(KneeOsteoarthritis,KOA)是以关节软骨退行性变和疼痛、僵硬、功能障碍为临床表现的疾病,它耗费了我国大量的居民健康保障资源,成为我们实现健康中国2030战略的一个巨大挑战。目前其发病机制尚不完全清楚,从病理角度来看,是一种以关节软骨退变和关节周围骨质增生为特征的慢性进行性骨关节病。导师课题组经过三十余年的临床经验及文献研究认为膝骨关节炎的发生、发展中,涉及多种因素,而“虚、瘀、毒”与本病密切相关。中老年人气血不和、脾胃运化失调,肝肾亏虚,本虚为先,经脉闭阻、瘀血内生、久病必瘀,复感风寒湿外邪、邪胜谓之毒,瘀而化毒,进而“瘀、毒”致虚,从而导致“虚、瘀、毒三邪互结”之痹证。导师课题组将加味独活寄生合剂作为KOA防治的主要治疗手段之一,已在临床开展多年,并通过临床观察,证实加味独活寄生合剂KOA可缓解局部疼痛症状,有效改善膝关节功能,降低关节液中的炎症因子。加味独活寄生汤组成:独活、桑寄生、杜仲、川牛膝、细辛、秦艽、茯苓、肉桂、防风、川芎、党参、甘草、当归、白芍、熟地黄、制南星、黄芩、木瓜、威灵仙。我们采用补益肝肾、活血化瘀、解毒除痹的自制药加味独活寄生合剂治疗膝骨关节炎,取得良好临床疗效。而牛膝是加味独活寄生合剂主要成分之一。本实验以探究牛膝多糖对人膝关节软骨细胞增殖及凋亡的影响为重点,为牛膝治疗膝骨关节炎奠定理论基础。目的1.验证牛膝多糖对软骨细胞是否具有毒性作用;2.证实牛膝多糖对软骨细胞增殖及凋亡的影响;3.明确牛膝多糖对软骨细胞中Caspase-3/9蛋白表达的影响,探索牛膝治疗膝骨关节炎在细胞分子水平的理论机制。方法1.采用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶两步酶消化法获取并培养原代人膝关节软骨细胞,倒置显微镜、甲苯胺蓝染色鉴定;2.采用IL-1β造模人膝骨关节炎关节软骨细胞环境,并用不同浓度的牛膝多糖干预;3.CCK-8法检测牛膝多糖对人膝关节软骨细胞的毒性作用以及增值的影响;4.流式细胞术检测牛膝多糖对人膝关节软骨细胞凋亡的影响;5.Western blot检测牛膝多糖对人膝关节软骨细胞凋亡蛋白Caspase-3/9表达水平的影响。结果1.采用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶两步酶消化法成功获取并培养原代人膝关节软骨细胞,并经鉴定后,符合实验要求;2.IL-1β干预后的软骨细胞凋亡率明显增加,满足膝骨关节炎软骨细胞模型要求;3.CCK-8法检测提示,一定浓度下牛膝多糖对软骨细胞无毒性作用,P>0.05;与对照组相比,50mg/L、100mg/L、200mg/L浓度牛膝多糖能够促进软骨细胞增殖,P<0.05;4.流式细胞术检测结果提示,与对照组组相比,50mg/L、100mg/L、200mg/L牛膝多糖实验组软骨细胞凋亡率明显下降,P<0.05;5.Westernblot检测结果提示,与对照组相比,各实验组软骨细胞中凋亡蛋白Caspase-3/9表达水平明显下降,P<0.05;结论一定浓度的牛膝多糖能促进软骨细胞的增殖,抑制软骨细胞的凋亡,从而维持软骨基质的稳定,延缓软骨细胞的退变,其机制可能是通过抑制Caspase-3/9-CASP3途径发挥作用。