先天性心脏病(Congenital heart disease, CHD)是我国排名第一的出生缺陷,是导致婴幼儿死亡和残疾的重要原因,严重影响了我国的人口素质,给社会和家庭带来了沉重的负担。近年来临床实验证明孕前补充叶酸可以显著减低CHD的发生,由此可知叶酸及其代谢通路基因与CHD的发生关系重大。尽管国内外在叶酸代谢基因和CHD易感性方面做了大量的研究工作,并鉴定出一些致病的多态位点,如MTHFR c.677 C>T、c.1298 A>C等,但不同研究中结果不一致,且缺乏相关的分子生物学功能验证,仍有许多问题尚待解决：(1)大多数研究将注意力集中在早期文献报道的、一直以来受到广泛关注的SNP上,而不是搜寻新的功能性致病多态,例如对MTHFR c.677 C>T、c.1298 A>C、MTRR c.66 A>G等多态的研究从十多年前持续至今,但却始终得不到一致结果；(2)研究的基因区域侧重基因编码区,关注因氨基酸变化导致的基因功能异常是否会提高先心病易感性,很少对基因非编码区进行系统研究来探讨基因剂量与CHD的关系；(3)随着dbSNP、HapMap数据库的日益完善,研究者们倾向于根据数据库信息挑选tagSNP开展自己的研究,然而不同种族、不同群体的SNP分布和频率存在差异,完全根据数据库信息挑选tagSNP难免会遗漏很多重要遗传信息；(4)先天性心脏病样本很难收集,因此国内外大多数研究样本量都有一定局限,很少有研究募集到500例以上病例进行遗传学方面研究,因此效力有限,且容易出现假阳性。为了探讨中国人群叶酸代谢途径核心基因和CHD易感性是否存在联系,并在研究方法上解决上述问题,我们在上海、江苏、山东三个省市收集了总计2,340例CHD病例和2,270例健康对照样本,挑选出32个样本对叶酸代谢途径中甲硫氨酸合成酶(MTR)、甲硫氨酸合成还原酶(MTRR)、胱硫醚p合酶(CB5)、胸苷酸合酶(TYMS)四个核心基因的启动子和3’UTR进行了测序,根据测序结果挑选最小等位基因频率大于10%的tagSNP,在三个人群中进行基因分型和关联分析。在找到与疾病易感性相关的阳性位点后,我们进一步对其进行了功能上的分析。因为叶酸代谢与癌症的发生息息相关,因此我们还分析了阳性位点与癌症患病风险的关联。通过关联分析,我们共找到4个非编码区多态位点与先天性心脏病易感性相关,并在三个人群中得到了一致的结果,其中MTR-186 T>G (rs28372871)、+905 G>A (rs1131450)、MTRR c.56 A>C (rs326119)是风险型SNP, CBS -551 C>G (rs2850144)是保护型SNP。MTR基因编码甲硫氨酸合成酶,在叶酸代谢中的主要功能是将5-甲基四氢叶酸(5m-THF)的甲基传递给同型半胱氨酸(HCY),生成四氢叶酸(THF)和甲硫氨酸(MET)。该基因中的两个风险因子分别位于启动子区和3’UTR区,二者均能显著增加先心病的患病风险,其中启动子区多态-186 T>G多态的G等位基因为风险因子,其GG基因型能增高1.56倍的患病风险(adjusted OR=1.56,95％CI=1.33.1.83,P=1.32×10-9)。in vivo的qRT-PCR和in vitro的Luciferase实验证明,-186 G等位基因启动转录的活性低于T等位基因,我们通过软件预测、EMSA、SPR、CHIP等手段证实了导致G等位基因转录活性低的原因是该多态T到G的变化使得启动子和转录激活因子USF的亲和力下降。另一方面从表观遗传学视角出发,我们发现-186 G等位基因的甲基化状况比T等位基因有显著升高,因此会进一步降低其转录活性。位于3’UTR的+905 G>A多态的A等位基因为风险因子,其GA、AA基因型分别能提高1.2倍和2.74倍的患病风险(GA: adjusted OR=1.2,95%CI=1.06-1.36;AA:adjusted OR=2.74,95% CI=2.09-3.60,P= 6.35×10-14)。功能研究发现,该多态由G到A的变化,会加大三种microRNA (miR-485、miR-608.miR-1293)对MTR基因的抑制力度,在翻译水平降低MTR的表达水平。我们还在522例健康志愿者血浆中检测了同型半胱氨酸的水平,结果发现-186 G和+905 A能显著增高体内血浆的HCY水平。关联分析以及HCY水平分析的结果表明这两个SNP可以协同作用,进一步增大CHD的患病风险。MTRR基因编码酶的主要功能是维持足够的活化形式的维生素B12,后者是MTR的辅酶。实验中发现的阳性位点c.56+781 A>C位于MTRR第一内含子,其C等位基因会显著提高CHD易感性,CA基因型和CC基因型分别会将CHD患病风险提高1.4倍和1.84倍(GA:ajust OR=1.4,95%CI=1.23-1.59;CC:ajust OR=1.84,95%CI=1.54-2.2;P=4.34×10-12)。在功能实验中我们通过qRT-PCR检测心组织中MTRR mRNA的量,通过Luciferase报告基因系统in vitro检测不同等位基因的转录活性,二方面的结论一致,表明c.56+781 C等位基因会显著降低转录活性,SPR实验证实C等位基因和核提取物物的亲和力确实低于野生型的A等位基因。我们也发现在健康人群中CC基因型携带者的血浆HCY浓度要高于AA基因型。CB5的功能是通过硫化作用直接催化HCY与丝氨酸缩合成胱硫醚,是HCY释放的途径之一。在关联分析中我们发现,位于启动子区的-551 C>G多态能降低CHD的患病风险,这种保护效应随着G等位基因数目的增加而增强,其CG基因型和GG基因型个体分别可降低15%、40%的CHD患病风险(CG:adjust OR=0.85,95%CI=0.75-0.96;GG:adjust OR=0.6,95%CI=0.49-0.73;P=6.62×10-7)。通过检测CBS的mRNA水平和Iuciferase报告基因验证,我们发现G等位基因的保护作用可能来源于提高的转录活性和表达量。在后续功能实验上我们发现-551C>G也受到了遗传学和表观遗传学两方面调控,一方面C到G的变化会降低转录抑制因子SP1与启动子的结合,从而激活转录；另一方面我们检测了-551 C>G附近区域的CpG位点甲基化状况,发现G等位基因对应的甲基化程度仅有C等位基因的1/7,无疑会进一步提高转录能力。以上4个多态主要围绕叶酸代谢通路的三个重要作用,即同型半胱氨酸的移除、甲基化和DNA合成原料的提供。MTR、MTRR中三个风险多态都能大幅度降低基因的表达量,从而使得HCY在体内堆积、THF和MET的供应不足,这种情况在胎儿在心脏发育期间更显严峻,因为其他代偿途径在心脏发育初期并未形成。而CBS的保护作用则强调了HCY在CHD发生中的风险作用,尽管有研究认为CBS在胚胎发育初期表达量仅有成人的20%,但本文中发现的多态能大幅提高CB5的表达量,对CHD的发生有着显著的保护作用。在实验中我们也对MTHFR c.677 C>T、c.1298A>C、MTR c.2756 A>G和MTRR c.66 A>G四个编码区多态位点的进行了分析,结果除了MTHFR c.1298 A>C在山东、江苏人群中会提高CHD患病风险之外,其他位点均与CHD易感性无关。将这4个编码区多态分型信息与我们发现的4个非编码区多态结果放在一起,进行多元Logistic回归分析后发现MTR-186 T>G、+905 G>A、MTRR c.56+781 A>C、CBS-551 C>G对表型的贡献是独立的。而在HCY队列中,通过多元回归分析发现,上述8个位点总共可以解释中国汉族人群HCY总变异的24.6%。其中MTR-186 T>G、+905 G>A和MTHFR c.677 C>T分别贡献了10.6%、5.7%、6.7%。叶酸代谢与癌症的发生关系密切,因此我们最后检测了文中所述各多态与前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌的易感性关联。结果在关联分析中发现MTR+905 G>A多态与上述四种肿瘤均存在关联,MTR-186 T>G只与前列腺癌和肺癌的发生相关,而CBS-551 C>G则能降低乳腺癌和肺癌的发生风险。