肌肉生长抑制素基因(Myostatin,MSTN)作为骨骼肌生长发育的负调控因子,对骨骼肌的生长具有抑制作用。MSTN基因自然突变的现象已经在牛、羊、狗等动物中发现,均表现为肌肉肥大。研究发现,MSTN基因突变能够增加卵泡抑素基因(Follistatin)的表达水平,并潜在地改变肌肉中肌纤维类型的分布和肌球蛋白重链的表达水平。目前,MSTN基因单侧突变动物的研究相对较少。猪作为研究人类骨骼肌生理功能最适宜的动物模型,其解剖学和生理学特性与人类是非常相似的。因此,本研究结合体细胞核移植和胚胎移植技术,利用已建立好的MSTN基因单侧敲除猪(MSTN+/-)细胞系,生产雄性的MSTN+/-猪,探索MSTN基因单侧敲除对猪半腱肌和半膜肌的肌肉重量、肌纤维横断面积和数量、肌纤维类型的分布以及肌球蛋白重链亚型的表达的影响。主要实验内容及结果如下:1、生产MSTN+/-猪。利用已通过转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)打靶技术建立的MSTN基因单侧敲除猪胎儿成纤维细胞系(MSTN基因单链缺失5-bp),经过体细胞核移植技术获得MSTN+/-重构胚,与野生型(WT)供体细胞获得的重构胚胎对比,二者具有相似的分裂率、囊胚形成率和囊胚细胞数。将MSTN+/-克隆胚胎移植到代孕母猪体内获得MSTN+/-仔猪。并发现MSTN基因单侧敲除降低新生猪半腱肌和半膜肌中的MSTN基因的表达水平,并提高Follistatin基因的表达水平(P<0.05)。2、检测新生的MSTN+/-猪半腱肌和半膜肌的组织形态学特性。取材发现,MSTN+/-猪的半腱肌和半膜肌的肌肉横断面积较WT猪大。与WT猪相比,MSTN+/-猪两种肌肉的绝对肌肉重量和相对肌肉重量均明显提高(P<0.05)。对新生的MSTN+/-猪和WT猪的半腱肌和半膜肌组织切片进行苏木精伊红染色,在MSTN+/-猪中,两种肌肉的肌纤维横断面面积明显高于WT猪,但MSTN+/-猪和WT型猪半腱肌和半膜肌的肌纤维数量均无显著性差异。结果表明,新生的MSTN+/-猪肌肉质量的提高,主要是MSTN单侧敲除使肌纤维肥大导致的。3、观察肌纤维类型的分布。试验利用免疫荧光染色法标记肌球蛋白重链Ⅰ型蛋白,在MSTN+/-猪中,半腱肌和半膜肌慢肌纤维比例明显低于WT猪(P<0.05)。进一步进行琥珀酸脱氢酶染色,发现在相同条件下染色,MSTN+/-猪两种肌肉与WT猪相比呈现更低的琥珀酸脱氢酶活性,可推测MSTN+/-猪拥有更多的快酵解型肌纤维。结果表明,MSTN基因单侧敲除能够改变新生猪肌纤维类型的分布,提高快酵解型肌纤维的比例。4、比较肌球蛋白重链亚型的表达水平。试验通过实时定量PCR方法,检测MSTN+/-猪的半腱肌和半膜肌中肌纤维类型相关基因,肌球蛋白重链Ⅰ型(MHCl)、ⅡA型(MHCⅡA)、ⅡB型(MHCⅡB)的表达水平。结果发现,在MSTN+/-猪的半腱肌和半膜肌中,MHCⅡB基因表达水平明显高于WT猪(P<0.05),MHCⅡA基因表达水平在两组中无显著差异,MHCI基因表达水平仅在半腱肌中高于WT猪,说明MSTN+/-猪肌纤维类型向快酵解型纤维转变。上述结果表明,猪MSTN单侧敲除重构胚具有与WT供体细胞重构胚具有相似的体内外发育能力,MSTN单侧敲除能够显著降低新生猪半腱肌和半膜肌的MSTN基因的表达水平,提高Follistatin基因的表达水平。新生的MSTN+/-猪的体重、半腱肌和半膜肌的肌肉重高于WT猪,主要是由于MSTN单侧敲除增加肌纤维大小导致的。除此之外,MSTN单侧敲除改变新生猪半腱肌和半膜肌肌纤维类型的分布,提高快肌纤维的比例和肌球蛋白重链ⅡB型基因的表达量,降低琥珀酸脱氢酶的活性,使肌纤维类型向酵解型纤维转变。