牛流行热（bovine ephemeral fever,BEF）是由牛流行热病毒（bovine ephemeral fever virus,BEFV）引起的一种急性、热性的动物疫病,该病可导致奶牛产奶量降低,役用牛跛行或瘫痪,部分怀孕母牛流产,给养牛业造成了重大经济损失。目前,国内外尚无BEFV的商品化检测试剂盒。BEFV检测方法的研究主要集中于RT-PCR、微量中和试验和实时荧光定量PCR等病原检测,其血清学抗体检测方法研究较少。BEFV的G蛋白是主要的免疫原性蛋白,其G1抗原表位比较保守,为BEFV所特有,只与牛流行热阳性血清发生反应,而其它抗原表位与同科的其他病毒存在交叉反应。本实验开展了G1抗原表位肽的原核表达、纯化、多克隆抗体制备及ELISA方法建立的研究,取得的主要研究进展如下:1.本实验成功构建原核表达载体,获得了纯化的BEFVG1抗原表位肽。将BEFV G1抗原表位序列3次串联进行DNA合成、构建重组的载体p ET-28a-G1表位肽,将重组载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,摇菌,经诱导条件的筛选与优化,G1表位肽最佳诱导条件为:IPTG浓度为1.0mmol/L、温度为25℃及诱导时间为6h,此条件下抗原表位肽表达量最高。经过对G1表位肽的可溶性分析及其鉴定,结果表明G1表位肽为可溶性蛋白。利用Ni-NTA亲和层析方法对G1表位肽进行优化,纯化后的G1表位肽经BCA试剂盒测定其浓度,浓度为2.5mg/m L。2.本实验制备了G1表位肽多克隆抗体,可作为检测抗体应用于BEFV G蛋白的检测。将G1表位肽和G1表位肽-KLH（血蓝蛋白）偶联蛋白作为免疫原,以PBS为对照,分别使用弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂免疫昆明鼠,经3次免疫后,眼球采血,分离血清,测定ELISA的反应效价。结果表明,G1表位肽免疫原性较差,G1表位肽-KLH具有较好的免疫原性,弗氏佐剂组和氢氧化铝佐剂组无显著差异;G1表位肽-KLH为免疫原制备的多克隆抗体ELISA反应效价为1:51200。将G1表位肽-KLH多克隆抗体作为一抗,进行Western blot检测,可特异性检测到BEFV G蛋白,为BEFV G蛋白的功能研究提供检测抗体。3.本实验建立了BEFV间接ELISA检测方法。将纯化的G1表位肽作为包被抗原,对ELISA反应条件进行了优化。优化后的反应条件:G1表位肽包被浓度为1.25μg/m L,37℃包被2h,10%的马血清37℃封闭1h,待检血清1:100稀释、37℃孵育1h,二抗1:10000稀释、37℃孵育1h,TMB显色15min,加入1M H2SO4的终止液,酶标仪测定OD450nm值。判定标准:若待测样品的OD450nm值≥0.4时,则判定为阳性;OD450nm值<0.4时,判定为阴性。对该方法进行评估,发现该包被抗原与牛副流感病毒3型和牛病毒性腹泻粘膜病病毒均无交叉反应;其板内及板间重复性试验的变异系数均小于5%;血清稀释1:320时,结果依然呈阳性。4.BEFV间接ELISA检测方法初步应用于临床样本的检测。分别用ELISA方法和中和实验（VNT）对23份血清样品进行比对实验,ELISA方法检测的阳性率56.52%,VNT检测阳性率为43.48%;利用所建立的ELISA方法对67份采自天津武清区三个规模化牧场的牛血清样本进行检测,阳性率为49.25%,表明该地区牛场存在BEFV的感染与流行。