来源于粉红螺旋聚孢霉Clonostachys rosea的玉米赤霉烯酮水解酶（ZHD101）可以有效降解谷物农副产品和饲料中的霉菌毒素玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）,然而天然酶固有的低热稳定性限制了其应用潜力。传统的定向进化可以对蛋白质的特定性质进行提升,但是建立和筛选突变文库所需的工作量较大。随着结构生物学,计算生物学以及计算机技术的快速发展,不断有先进的蛋白质改造相关算法涌现,蛋白质计算设计成为了未来蛋白质工程中的重要方向。本文以ZHD101作为模式蛋白,结合多种计算手段,通过两种不同的策略对其分子结构进行提高热稳定性的突变设计并结合实验验证。主要研究结果如下:（1）基于酶分子的动力学特征,筛选并改造ZHD101中的柔性及温度敏感区域,提高其结构稳定性。通过比对不同温度下的分子动力学模拟轨迹,选取32个柔性位点;再通过位置特异性评分和酶构象自由能计算,从32个柔性位点上的608个虚拟饱和突变体中筛选出12个突变体。经实验验证有效性为25%,其中3个突变体N156F、S194T和T259F,它们的热熔融温度提升显著（ΔTm>4°C）且酶活性与野生型类似甚至更高（相对酶活性为95.8%、131.6%和169.0%）。分子动力学模拟分析显示,突变体结构热稳定性的提高会受到NH-π作用力的引入、盐桥网络重排、分子表面空穴填充等因素的影响。对3个突变体进行迭代组合突变后,N156F/S194T突变体的热稳定性提升效果更好（ΔTm=6.7°C）。（2）基于PROSS策略提供的组合突变体设计,通过对位点进行性质表征进行优化重新组合,减少了热稳定性改造过程中酶活性的损失。PROSS计算策略提供了7组组合突变体（D1-D7）,热稳定性和酶活性的的测定显示,随着更多突变位点的叠加,突变体的热熔融温度逐渐提高,而相对酶活性却不断降低。为了实现突变位点的高效组合,我们对33个突变位点进行单点突变构建和性质测定,重新筛选了4个突变体S8T、K66D、T138L和V251E,它们的热熔融温度有所提高（ΔTm>2°C）且相对酶活性（>90%）和残余酶活性（>40%）均与野生型接近甚至高于野生型。组合后的四点突变体abcd（S8T/K66D/T138L/V251E）的热熔融温度提升了17.6°C,相对酶活性和残余酶活性分别达到了118.4%和103.6%。分子动力学模拟显示,abcd的波动性降低,减少了亚构象状态的转换。这些构象变化可能是由于四个突变分别从盐桥相互作用和CH-π相互作用等因素产生,进而实现热稳定性提高。本研究成功地通过计算设计实现了ZHD101热稳定性的增强,为提升其应用潜力提供了相关依据和理论基础。同时,本研究表明基于柔性区域的虚拟饱和突变和对自动化计算设计策略的筛选与优化在酶稳定性改造上的可行性,其分子改造中构象自由能计算及构象动力学等方面的信息有助于进一步探索基于计算设计的虚拟改造,实现高效的酶改造。