论文部分内容阅读
背景:Hca-P细胞和Hca-F细胞是本课题组通过将同一小鼠腹水型肝癌细胞不断接种615小鼠足垫,而筛选并分离出高低淋巴道转移潜能不同的两个亚克隆细胞株,其中Hca-P细胞淋巴结转移率<30%,为低淋巴道转移细胞,Hca-F细胞淋巴结转移率>70%,为高淋巴道转移细胞。在前期研究中,我们发现Hca-F细胞中ANXA7 mRNA的表达是Hca-P细胞中的3.48倍,Hca-F细胞中ANXA7蛋白质的表达是Hca-P细胞中的3.0倍,且ANXA7表达下调后,小鼠肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力均减弱,同时可促进凋亡。提示ANXA7可能是决定肝癌细胞淋巴道转移潜能的关键基因之一。核心岩藻糖基化是蛋白质翻译后修饰的一种,其水平的异常表达与恶性肿瘤的发生密切相关,Fut8（a-1,6岩藻糖基转移酶移）是催化核心岩藻糖合成唯一的糖基转移酶,GDP-岩藻糖是核心岩藻糖基化过程中的底物之一。在高尔基体内Fut8催化岩藻糖残基从GDP—岩藻糖转移至乙酰氨基葡萄糖（GIc NAc）或更复杂的N聚糖中,构成核心岩藻糖。研究发现,ANXA7包含有胰岛素、Ca2+以及磷脂结合位点,参与介导Ca2+/GTP信号通路,相当于激活的GTP酶。所以,研究ANXA7与核心岩藻糖基化蛋白质之间的相互关联对探讨肿瘤的发生机制有重要作用,可为临床应用提供新的治疗思路。目的:本实验通过细胞转染、Western Blot、qRT-PCR等技术,对比观察过表达和下调小鼠肝癌Hca-P细胞ANXA7基因调控对HnRNP A2/B1、PDLIM1、RBM4基因及蛋白表达水平的影响,进而分析ANXA7与核心岩藻糖基化蛋白质之间的作用关系。通过细胞转染、Western Blot、qRT-PCR、CCK-8、Transwell小室等实验,观察HnRNP A2/B1基因对Hca-P细胞生物学行为的影响。方法:1、构建PG-CMV-EGFP-Kan/neo-ANXA7表达载体,稳定转染至Hca-P细胞,获得ANXA7过表达的Hca-P细胞株;构建pGPU6-GFP-neo-sh RNA-ANXA7表达载体,稳定转染至Hca-P细胞,获得ANXA7表达下调的Hca-P细胞株;利用Western Blot、qRT-PCR技术验证ANXA7基因调控对HnRNP A2/B1、RBM4、PDLIM1蛋白及mRNA表达水平的影响。2、构建pGPU6-GFP-neo-sh RNA-HnRNP A2/B1表达载体,稳定转染至Hca-P细胞,获得HnRNP A2/B1表达下调的Hca-P细胞株;利用CCK-8试剂盒和Transwell小室比较HnRNP A2/B1下调组和对照组增殖、侵袭、迁移能力,分析HnRNP A2/B1对Hca-P细胞的生物学行为影响。结果:1、在mRNA水平上,sh RNA-ANXA7细胞组与对照组N1-Control细胞组相比,ANXA7的基因表达水平下降至原水平的10%,HnRNP A2/B1的基因表达水平下降至原水平的29%,RBM4的基因表达水平下降至原水平的22%,PDLIM1的基因表达水平下降至原水平的57%;在蛋白质水平上,sh RNA-ANXA7细胞组与对照组N1-Control细胞组相比,ANXA7,HnRNP A2/B1的蛋白质表达水平下降至原水平的35%,RBM4的蛋白质表达水平下降至原水平的40%,PDLIM1的蛋白质表达水平下降至原水平的56%。这些结果表明,ANXA7表达抑制后,HnRNP A2/B1、RBM4、PDLIM1的表达降低。2、在mRNA水平上,pc DNA-ANXA7细胞组与对照组pc DNA3.1细胞组相比,ANXA7的基因表达水平升高至原水平的2.69倍,HnRNP A2/B1的基因表达水平升高至原水平的1.81倍,RBM4的基因表达升高至原水平的1.41倍,PDLIM1的基因表达水平升高至原水平的1.5倍;在蛋白质水平上,pc DNA-ANXA7细胞组与对照组pc DNA3.1细胞组相比,ANXA7的蛋白质表达水平升高至原水平的1.8倍,HnRNP A2/B1的蛋白质表达水平升高至原水平的2倍,RBM4的蛋白质表达水平升高至原水平的1.35倍,PDLIM1的蛋白质表达水平升高至原水平的1.2倍。这些结果表明,ANXA7过表达后,HnRNP A2/B1、RBM4、PDLIM1的表达升高。3、HnRNP A2/B1转染后,sh RNA-HnRNP A2/B1细胞组与对照组N2-Control细胞组相比,在mRNA水平上,HnRNP A2/B1的基因表达水平下降至原水平的20%,在蛋白质水平上,HnRNP A2/B1的蛋白表达水平下降至原水平的35%,此结果表明HnRNP A2/B1低表达的细胞株sh RNA-HnRNP A2/B1细胞株构建成功。4、CCK-8实验分别测得Hca-P细胞组、sh RNA-HnRNP A2/B1细胞组、N2-Control细胞组在0小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时的吸光度值,Hca-P细胞组分别为0.113±0.010、0.156±0.023、0.467±0.013、0.572±0.012、0.668±0.009、0.712±0.014;sh RNA-HnRNP A2/B1细胞组0.116±0.020、0.148±0.013、0.241±0.013、0.390±0.012、0.460±0.009、0.469±0.014;N2-Control细胞组分别为0.126±0.013、0.166±0.021、0.478±0.013、0.570±0.013、0.650±0.010、0.690±0.013,结果提示sh RNA-HnRNP A2/B1细胞组的增殖速度低于Hca-P细胞组和N2-Control细胞组。5、Transwell细胞迁移实验中,Hca-P细胞组穿透小室膜的细胞平均数目为90.25±4.56,sh RNA-HnRNP A2/B1细胞组穿透小室膜的细胞平均数目为28.96±3.24,N2-Control细胞组穿透小室膜的细胞平均数目为102.7±2.82;Transwell细胞侵袭实验中,Hca-P细胞组穿透小室膜的细胞平均数目为80.15±3.56,sh RNA-HnRNP A2/B1细胞组穿透小室膜的细胞平均数目为21.54±4.24,N2-Control细胞组穿透小室膜的细胞平均数目为85.07±2.74,这些结果说明,HnRNP A2/B1低表达后,sh RNA-HnRNP A2/B1细胞组与Hca-P细胞组和N2-Control细胞组相比,迁移、侵袭能力均降低。结论:ANXA7基因调控HnRNP A2B1、PDLIM1、RBM4的表达,在mRNA水平和蛋白水平,这些核心岩藻糖基化蛋白质的表达随着ANXA7的下调而低表达,随着ANXA7的过表达而高表达;当HnRNP A2/B1低表达后,Hca-P细胞的增殖、迁移、侵袭能力均明显下降;ANXA7、RBM4、HnRNP A2B1、PDLIM1可能共同参与了肿瘤细胞的生物学活动,并且ANXA7也间接参与核心岩藻糖基化蛋白质修饰的过程,与肿瘤的发生发展密切相关。