研究目的:神经营养素家族是一类由靶组织分泌,具有促进和维持神经细胞生存、生长、分化等功能的特异性蛋白质或多肽类分子。神经营养素-4是第四个被发现的神经营养素家族成员,研究表明神经营养素-4对鸡胚背根神经节的感觉神经元的存活和生长有促进作用。但人神经营养素-4（hNT-4）在机体内含量非常低,因而限制了对它的研究。本实验的目的就是要通过克隆hNT-4成熟蛋白基因片段,并使其在高效原核表达载体中大量表达和纯化,得到高纯度蛋白,为对hNT-4的进一步研究打下基础。 研究方法:以正常人外周血淋巴细胞基因组DNA为模板,通过常规PCR扩增出hNT-4成熟蛋白基因片段。再通过双限制性内切酶进行酶切,连接入高效原核表达载体pET32a中,重组质粒pET-NT4在大肠杆菌DH5α中进行克隆后,转化入其表达宿主菌BL21（DE3）中进行表达。对重组菌表达条件进行优化后,对重组菌进行扩大培养,使其诱导表达出带有hNT-4成熟蛋白的融合蛋白。超声波破碎菌体后,分离出包涵体后,将包涵体溶于8M尿素后,通过Ni²⁺-鏊合亲和层析柱进行纯化。 研究结果:克隆得到的hNT-4成熟蛋白基因与GeneBank报道的序列除了有一个碱基不同以外,其余的都完全相同。重组质粒pET-NT4构建正确,在表达宿主菌中表达出了预期的融合蛋白。融合蛋白主要存在于包涵体中,包涵体溶于8M尿素后,用Ni²⁺-鏊合亲和层析柱对溶解液进行纯化,在0.15M咪唑洗涤液中得到的大部分融合蛋白,并且纯度达到94%。 研究结论:成功扩增出人神经营养素-4成熟蛋白基因片段,构建了原核表达重组质粒pET-NT4,表达得到人神经营养素-4成熟蛋白和硫氧还原蛋白的融合蛋白,纯化后得到了高纯度（94%）的融合蛋白。