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引言造血干细胞是目前研究较为深入的成体干细胞,具有向髓系、淋巴系及其下游细胞多向分化的潜能,是极富应用前景的研究领域。血细胞形成是生物体发育和生命维持的重要环节之一。机体内血细胞形成过程的调控主要表现为多能造血干细胞本身的自我更新及造血干细胞向各个血细胞系分化成成熟血细胞的连续而又分阶段的过程中。这些过程涉及大量基因有序开启和关闭这种复杂而又精密的调控过程。调控异常可导致多种血液病的发生。近年研究证明,miRNA在正常造血过程中发挥了重要作用,包括监控个体发育时相转变、调控特定细胞增殖、分化、凋亡进程等,与血液系统肿瘤的发生、发展密切相关。造血干细胞分化各阶段特异的miRNAs功能研究是干细胞调控机制研究的热点,其功能研究对揭示正常干细胞如何转变成白血病干细胞,白血病的发生机制,白血病的诊断和治疗等关键问题都将打下良好的基础。在人急性髓性白血病患者中,大量的白血病细胞是源于髓性祖细胞分化为成熟细胞的失败,因此,从本质上说,急性髓性白血病可归为正常分化被阻断,大量粒细胞增生的白血病亚类。为此,本研究运用microRNA芯片,通过急性髓性白血病患者骨髓细胞与正常人骨髓细胞比对,筛选出其异常表达的miRNAs,经统计学方法分析处理后锁定数量不多的“目标miRNAs",生物信息学分析预测并经生物学实验验证其作用靶点,体外建立增殖、分化模型,探讨过表达特异的“目标miRNAs"对细胞分化和增殖的影响,明确其功能。研究结果为探明miRNAs调控细胞(正常干细胞及白血病细胞)发育的分子机制、探索诱导细胞分化、增殖的新手段以及白血病发生机制提供理论指导和实验依据。目的1.了解正常人骨髓单个核细胞与急性髓性白血病病例骨髓单个核细胞miRNAs表达谱,筛选获得急性髓性白血病发病相关特异的miRNAs。2.了解急性髓性白血病发病相关特异miRNAs的作用靶点以及对小鼠干／祖细胞细胞及急性髓性白血病细胞系增殖、分化及凋亡功能的调控作用,探讨其在急性髓性白血病发生发展中的作用。方法1.应用Exiqon 10.0版的miRNA表达谱芯片杂交,比较正常人骨髓单个核细胞与急性髓性白血病病例骨髓单个核细胞miRNAs表达谱,TIGR Mutiple Array Views软件包(TMeV version 4.0)及统计分析后获取急性髓性白血病差异表达的miRNAs;同时用Affymetrix基因芯片分析正常人骨髓单个核细胞与急性髓性白血病病例骨髓单个核细胞基因表达谱,锁定差异表达的基因；选取急性髓性白血病差异表达的miRNAs (miR-17-92,miR-196b,miR-9),应用实时荧光定量RT-PCR方法加以验证；采用TargetScan与PITA等生物信息学分析软件预测系统差异表达的“目标miRNA"的靶基因。2.采用PCR方法克隆并构建急性髓性白血病特异miRNAs (Pre-miRNA)基因重组表达载体。3.运用荧光素酶／β半乳糖糖苷酶报告系统验证miR-17-92,miR-196b,miR-9作用的靶基因。4.利用克隆形成实验探讨过表达mir-17-92,mir-196b,mir-9对小鼠干／祖细胞细胞克隆形成能力及增殖能力的影响。5.观察过表达mir-17-92,mir-196b,mir-9对Hela、293T细胞及小鼠干／祖细胞细胞增殖、凋亡的影响。6.建立PMA诱导THP1细胞分化模型,以流式细胞仪检测单核细胞-巨噬细胞分化典型标记CD11b、CD14表达率的变化及Cytospin玻片瑞氏-姬姆萨染色观察细胞分化形态评估。7.实时定量PCR检测miR-17-92,miR-196b及miR-9在THP1细胞分化模型中的表达,过表达miR-17-92,miR-196b及miR-9对THP1细胞分化的影响。8.运用GeneGo信号通路分析系统初步分析miR-17-92,miR-196b及miR-9靶基因的相互关系并预测其可能参与调控的信号通路。结果1. miRNA芯片结果显示有112个miRNAs异常表达,经过TIGR Mutiple ArrayViews软件包(TMeV version4.0)及ANOVA等统计学方法数据分析后得出数目不多的“目标miRNAs "。结合文献我们选定了3个在急性髓性白血病病例中高表达的miRNA即miR-17-92,miR-196b,miR-9,结合基因芯片分析并利用TargetScan与PITA等生物信息学分析软件预测筛选出一些靶基因经荧光素酶／β-半乳糖苷酶报告系统验证后,miR-17-92可能的靶基因有：BIM(BCL2L11),PLK2等；miR-196b可能的靶基因有：CDKN1B等；miR-9可能的靶基因有：TGFBI等。2. mir-17-92、mir-196b及mir-9单独转染小鼠干／祖细胞后,总的来看,随着时间和传代的增加,各组细胞克隆数均急剧下降(P<0.05)。在第一代均产生大量的细胞克隆(>700),大大超过空载体转染小鼠干／祖细胞所产生的克隆数(300左右)(P<0.05)。miR-17-92、miR-196b及miR-9单独转染组多以细胞克隆类型Ⅲ为主。与此同时,Cytospin玻片染色细胞形态表明各组均有较多的未分化的单核细胞和粒细胞；第二代各组细胞克隆数大为减少,但有miR-9的两组减少趋势要少于其它组(P<0.05)。Cytospin的玻片染色细胞形态表明miR-9的两组仍有部分未分化的单核细胞和粒细胞,其它组(空载体组,有miR-17-92组)大部分即已分化为巨噬细胞,只有少数未分化的单核细胞和粒细胞；当miR-196b与miR-17-92或miR-9共转染时细胞克隆数比单独转染miR-17-92或miR-9克隆数要少(P<0.05),提示miR-196b均能抑制miR-17-92和miR-9对细胞克隆形成能力。3.在Hela细胞,293T细胞过表达mir-17-92、mir-196b在这两种细胞中细胞活力荧光强度均高于对照组(p<0.05),而凋亡酶荧光强度则均低于对照组(P<0.05)；在Hela细胞,293T细胞过表达mir-17-92后miR-17-19b的相对表达率高于对照组(P<0.05)；在小鼠干／祖细胞中过表达miR-17-92、miR-9后其细胞活力荧光强度均高于对照组(p<0.05),而凋亡酶荧光强度则均低于对照组(P<0.05),但过表达miR196b其活力荧光强度和凋亡酶荧光强度均与对照组比较无差异(p>0.05)；过表达miR196b+ miR-9和miR196b+miR-17-92的细胞活力荧光强度、凋亡酶荧光强度与对照比均有差异(p<0.05)。4.PMA处理THP1细胞后,随时间的增加巨噬细胞样细胞的蛋白标记CDllb,CD14表达率也增加(F=10.084,P=0.003),PMA处理时间于48h,72h,96h时间点CDllb, CD14表达率与未用PMA处理的THP1细胞(对照)比较均增高(p<0.05),尤其是CDllb表达率。Cytospin(细胞瑞氏-吉姆萨染色)细胞形态显示PMA处理48h,72h,96h时间点细胞胞体变小,核质比例减小,核变小且明显凹陷扭曲,大部分呈现杆状核或分叶核。5.THP1细胞分化模型各时间点总RNA电泳出现预期清晰条带,A260/A280值全部在1.9-2.1,显示结果良好。TaqMan定量PCR检测miR-9、miR-17-92和miR196b在各时间点的表达结果显示,随着PMA处理THP1细胞时间的增长,miR-196b,miR-9和miR-17-92的相对表达率／量与未加PMA组(对照)均下降(p<0.05),PMA处理THP1细胞48h及72h时间点下降最为明显。6.在PMA诱导THP1细胞分化模型中,过表达mir-9、mir-17-92和mir196b基因48h后流式细胞仪检测CD11b、CD14表达率结果显示转mir-17-92、mir-196b和mir-9基因后细胞CD14、CDllb表达率低于对照(未加PMA THP1细胞及转空载体THP1细胞)(p<0.05);Cytospin的细胞形态观察显示在光镜下三种mir基因过表达组,更少的细胞表现出细胞胞体变小,核、质比例减小,核变小且明显凹陷扭曲的细胞形态变化。结论1.急性髓性白血病患者骨髓单个核细胞中mir-17-92、mir-196b和mir-9基因表达显著上调,可能与急性髓性白血病发生发展有关。2.克隆了一系列的急性髓性白血病患者表达异常的mir基因包括mir-17-92,mir-196b和mir-9基因,并成功构建到pMSCVneo及pMSCVPIG逆转录病毒表达载体。3.过表达miR-196b, miR-9和miR-17-92均能促进小鼠干／祖细胞细胞克隆的形成及增殖,但miR-196b能抑制miR-9或miR-17-92促进小鼠干／祖细胞细胞形成克隆的能力。4.在Hela细胞和293T细胞中miR-17-92、miR-196b均能促进细胞的增殖而抑制细胞凋亡；在小鼠干/祖细胞中,miR-17-92、miR-9均能促进细胞的增殖而抑制细胞凋亡,但miR-196b不能促进细胞的增殖也未见抑制细胞凋亡；miR-196b能抑制miR-17-92或miR-9对小鼠干／祖细胞的增殖及抗凋亡作用。5.成功建立了PMA诱导THP1细胞分化模型,为研究其它与分化有关的miRNAs打下了基础6. miR-196b, miR-9和miR-17-92都与急性髓性白血病细胞分化显著负相关。7. CDKN1B基因即细胞周期素依赖性激酶抑制因子,是miR-196b的直接靶基因。CDKN1B蛋白为调控细胞周期重要的因子,miR-196b可能通过此蛋白因子参与调节细胞增殖和分化的,这为进一步提示白血病的发生机制提供了思路。