铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又称为绿脓杆菌,属于革兰氏阴性菌,是一种条件性致病菌,它能感染人类、动物和植物。环二鸟苷酸（Cyclic diguanylate monophosphate,c-di-GMP）是细菌胞内第二信使小分子,调控诸多生物学功能,包括运动性、胞外多糖的分泌、致病因子的产生和生活方式由浮游自由个体向生物被膜状态的转变等。信号分子c-di-GMP通过结合多类受体调控细菌的生物学功能,目前已发现的受体包括转录调控因子,核糖开关等。其中含Pil Z结构域的蛋白是目前已知最大的一类c-di-GMP受体蛋白。然而,目前人们对Pil Z结构域蛋白功能及调控分子机制的了解非常有限。铜绿假单胞菌编码8个含有Pil Z结构域的c-di-GMP受体,其中包括4个功能未知单一结构域蛋白。我们以铜绿假单胞菌单一结构域Pil Z蛋白（PA0012,PA4324,PA4608,PA2799）为研究对象,系统研究这些蛋白致病相关生物学功能并对其中PA4608可能的致病机制进行了深入分析,研究结果将进一步深入我们对于c-di-GMP信号通路调控铜绿假单胞菌致病机理的了解。本论文中第一部分,我们首先利用同源重组的方法对编码具有保守c-di-GMP结合位点的四个单Pil Z结构域蛋白的基因进行了敲除,得到敲除突变体菌株ΔPA0012,ΔPA2799（hap Z）,ΔPA4324,ΔPA4608（map Z）,随后,以野生型菌株PAO1为对照,用这四个突变体进行了表型筛选。我们发现这4个单Pil Z结构域蛋白的突变导致铜绿假单胞菌的多种表型变化并不相同,表明这些蛋白可能调控各异的信号通路,比如群集运动能力,感染生菜的能力,对线虫的致病力和生物膜形成方式等。在转录水平上四个单Pil Z结构域蛋白突变导致的差异基因也各不相同,我们对这四个突变体和野生型菌株进行了RNA测序实验,经过分析的数据显示,相比较于野生型菌株,单Pil Z蛋白的缺失可能导致大量基因的差异表达,比如ΔPA0012和ΔPA4324;也可能只影响少数基因表达量的变化,比如Δmap Z就只有17个差异基因。这些基因包括编码多种致病因子的基因,能够影响细胞的生理进程,调控细菌的致病性。本研究针对突变后影响表型最多且差异基因最少的Map Z进行了蛋白功能及深入的致病机理研究。本论文第二部分主要阐述了Map Z介导的趋化受体甲基化修饰影响铜绿假单胞菌的致病性方面的研究。本实验室前期研究发现c-di-GMP受体Map Z与甲基转移酶Che R1互作调节依赖于Che R1的趋化受体Pct A的甲基化修饰,进而调控细菌鞭毛的旋转方向转换频率和趋化性;本论文第二章实验结果发现Map Z突变体对线虫的快杀死能力和生菜感染的能力降低。基于这些研究结果我们推测Map Z建立了细菌趋化性和c-di-GMP信号系统之间的联系,从而影响铜绿假单胞菌的致病性。铜绿假单胞菌基因组编码26个趋化受体,我们采用体外甲基转移实验发现,其中8个趋化受体的甲基化修饰依赖于Che R1。进一步的研究发现10u M c-di-GMP在有Map Z存在的情况下能显著抑制这8个趋化受体的甲基化修饰。已有文献报道显示Aer,Ctp H,Cpt M,Pct A和Pct B分别它们分别感受识别氧气/能量、无机磷酸盐、苹果酸和氨基酸等信号分子;另外3个趋化受体（PA1251,PA1608和PA2867）功能目前还未知。随后,我们利用Map Z过表达菌株PAO1/p Map Z进行了趋化性实验和感染实验。对趋化性实验结果的分析可知,相比较于野生型菌株,细胞内过表达Map Z能够抑制铜绿假单胞菌对化学引诱物的趋向性,并且也能够抑制细菌向划伤的A549细胞的游动。小鼠感染实验结果表明,Map Z过表达菌株一定程度抑制铜绿假单胞菌在小鼠体内的散播降低细菌毒力,导致小鼠的死亡率降低。为了进一步确PAO1/p Map Z菌株的实验结果均是由Map Z过表达所导致,我们先用HPLC方法测了Map Z过表达菌株与野生型菌株细胞内c-di-GMP的浓度,实验结果显示它们的c-di-GMP浓度没有显著性差异,说明Map Z过表达不是通过改变胞内c-di-GMP的浓度来影响细菌致病性的。随后,我们又进行了RNA测序实验,通过分析所得数据后,发现Map Z过表达菌株与野生型菌株相比较,仅有Map Z的表达量有显著性升高,该结果表明了在细胞内Map Z的过表达不会影响其它基因表达量的改变,并且能直接影响铜绿假单胞菌的致病性。综上所述,通过控制不同趋化受体蛋白的甲基化,c-di-GMP受体Map Z和细胞内的c-di-GMP可以对细菌的趋化性反应和致病性产生深远的影响。本论文中所做的工作能够使我们更进一步理解模式生物铜绿假单胞菌中单Pil Z结构域蛋白功能的多样性和重要性,也为我们研究其他假单胞菌的致病性提供了一种新的研究思路。