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河豚毒素（Tetrodotoxin,TTX）是一种剧毒的神经毒素,最早发现于河鲀卵巢,后来在陆生、水生等多种无亲缘关系的动物及海洋和淡水环境的沉积物中都发现了TTX。福建河鲀养殖以本地特色物种双斑东方鲀（Takifugu bimaculatus）和菊黄东方鲀（T.flavidus）为主,但不同养殖区域养殖水质不同、饲喂形式多样,同时这两个种类不同发育时期、不同季节中TTX的分布规律不明,河鲀个体间TTX含量存在着较大的差异,给食用者带来中毒的危险,限制了福建河鲀产业链的发展。明确TTX的分布规律和建立稳定的低毒或无毒河鲀的养殖方法和遗传育种至关重要。由于目前TTX生物合成过程与起源尚未明了,进行TTX合成的干预以降低TTX的合成量存在着极大的难度,这成为低毒或无毒河鲀的养殖方法和新品种培育研究的瓶颈。为此,我们以双斑东方鲀为研究材料,一方面通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的手段,了解TTX在其体内的分布规律,另一方面从TTX蓄积途径的调控入手,建立其蓄毒型动物模型,了解外源性TTX在模型体内蓄积的分布、消减及组织细胞显微定位的特点,同时通过对模型转录组的分析,初步探讨外源性TTX在双斑东方鲀体内的蓄积机制,筛选TTX蓄积相关基因,为将来基因干预,开发低毒或无毒双斑东方鲀可稳定遗传的新品种奠定基础。本文主要研究内容和结果如下:1.采用LC-MS/MS检测方法,（1）对养殖双斑东方鲀各生长阶段（精液、未受精卵、胚胎期、幼鱼期成体和成鱼期各组织）所含TTX进行定性定量分析,以明确养殖双斑东方鲀不同发育时期TTX的分布规律;（2）对野生双斑东方鲀成鱼各组织中TTX进行定性定量分析,与养殖双斑东方鲀相应组织中TTX含量分布进行比较,以了解养殖双斑东方鲀体内TTX的分布特点;（3）对养殖双斑东方鲀的养殖用水进行TTX的检测,以判断双斑东方鲀的养殖环境中是否存在外源性TTX。结果表明:（1）养殖双斑东方鲀精液、未受精卵、胚胎期、幼鱼期中存在TTX,但其TTX含量低于最小定量限;TTX在18月龄（未性成熟）成体中的分布规律为:皮肤>肝脏>（肾脏、肠、肌肉、脾脏、血液、眼睛中TTX含量低于最小定量限,不能精确进行TTX含量比较）;TTX在36月龄（性成熟,雌性）成体中的分布规律为:卵巢>血液>肝脏>皮肤>肠>脾脏>肾脏>眼睛>肌肉。TTX在36月龄成体肝脏中的含量高于皮肤,表明:在养殖双斑东方鲀生长过程中,TTX进行了重新分布。（2）TTX在野生双斑东方鲀成体中的分布规律为:卵巢>肝脏>皮肤>眼睛>肠>脾脏>肾脏>肌肉>血液。养殖双斑东方鲀成鱼肝脏中TTX的含量比野生成鱼低171倍,卵巢比野生低137倍,皮肤比野生低155倍,而血液却比野生高4.51倍,提示养殖双斑东方鲀与野生双斑东方鲀体内TTX的来源可能不同。（3）在养殖双斑东方鲀的养殖用水中能检测到TTX的存在,表明双斑东方鲀的养殖环境中具有外源性TTX的存在。2.采用灌胃给药的方法,建立外源性TTX蓄积的18月龄双斑东方鲀模型,结合LC-MS/MS法对蓄毒动物模型各组织的TTX进行检测分析,通过比较不同蓄毒时间模型中TTX含量的变化来追踪外源性TTX在双斑东方鲀体内消减的规律。结果显示:灌胃给药后24 h,蓄毒动物模型各组织中的TTX含量都显著升高;外源性TTX进入体内,血液中TTX含量增加明显,表明外源性TTX经血液进入各组织。灌胃给药后72 h,各组织TTX的含量均比24 h蓄毒动物模型相应组织明显降低,表明外源性TTX在各组织中蓄积后随时间推移发生消减,但仍然明显高于空白对照组。3.采用免疫组化的方法对24 h蓄毒动物模型的肝脏、卵巢、皮肤细胞中TTX蓄积的位置进行组织细胞显微定位观察分析。结果显示:（1）蓄毒动物模型的肝脏组织中,肝细胞的细胞质、静脉的单层扁平上皮细胞及静脉管中的部分血细胞、小叶间胆管管腔内侧呈现褐色阳性免疫反应。表明外源性TTX可能通过静脉运输至肝细胞质并通过胆管与其它组织联系。（2）蓄毒动物模型的卵巢组织中,卵巢壁及卵巢内结缔组织呈现褐色阳性免疫反应;卵母细胞卵黄囊及核物质具褐色阳性免疫反应,但皮层小泡与核仁为阴性反应。表明外源性TTX可能通过卵巢壁及卵巢结缔组织传送至卵母细胞的卵黄囊及细胞核中。（3）蓄毒动物模型的皮肤组织中,表皮层的扁平上皮细胞、囊状细胞、基底细胞显示为褐色阳性免疫反应,其中基底细胞层免疫反应强烈,提示外源性TTX可能由基底细胞,通过囊状细胞送达扁平上皮细胞层。4.对蓄毒动物模型的肝脏组织进行转录组测序、分析、筛选差异表达基因,挑选部分差异基因进行实时定量PCR以验证转录组测序结果的可靠性。结果显示:满足筛选条件的差异基因共32条,其中上调基因24条,下调基因8条。基因生物进程的功能主要集中在toll样受体信号通路、胰岛素样生长因子受体信号途径、精氨酸酶活性及N-末端肽基精氨酸乙酰化、糖蛋白合成与转运、与泛素样蛋白结合、卵黄蛋白原活性及卵黄膜形成、谷氨酰胺（天冬酰胺）酶活性、血小板合成与分泌、血管相关平滑肌细胞迁移、透明质酸生物合成过程的调控、器官生长、与瘦素刺激的细胞反应、中介复合体装配的调控等方面。表明外源性TTX的蓄积可能与蓄毒动物模型肝脏中微生物的大量存在、肝脏中精氨酸的结构、TTX在肝脏血管中的运输等密切相关。挑选了3条蓄毒相关基因进行RT-PCR验证,验证结果与转录组测序的变化趋势吻合,表明转录组测序结果可靠。