论文部分内容阅读
细胞色素P450单加氧酶（Cytochrome P450 monooxygenases）是一种广泛存在于自然界中的亚铁血红素–硫醇盐蛋白超家族,可催化羟基化、环氧化和O-脱烷基等多种类型的反应,特别是其可以在温和条件下,催化复杂化合物中惰性C-H键的区域和立体选择性氧化反应,从而实现传统化学反应难以实现的各类合成反应,因而其在有机合成,药物合成等方面具有很高的应用价值。为丰富P450酶作为合成生物学的酶元件库、探索新型催化反应进一步提高P450酶的应用价值,本研究利用生物信息学手段挖掘到来自两种不同菌株（Sphingomonas wittichii RW1和Variovorax paradoxus S110）的细胞色素P450单加氧酶并对它们进行异源表达和催化特性分析,主要研究结果如下:分别对这两种不同来源的P450酶进行异源表达,发现只有来源于Variovorax paradoxus S110菌株中的P450酶能在大肠杆菌中实现异源可溶表达,以下称之为P450VpMO。对其氨基酸序列进行分析并与其他已报道的P450家族蛋白氨基酸序列比对发现该酶属于P450酶CYP116B家族,是一种新型电子自供体类蛋白。P450VpMO的光谱学性质研究结果显示,其氧化状态在420 nm处有最大吸收峰,利用连二亚硫酸钠将P450VpMO还原并与一氧化碳结合后其最大吸收峰偏移至450 nm处,具有典型的P450酶光谱学特征;以4’-甲氧基苯乙酮脱甲基反应为模式反应对P450VpMO的酶学性质进行研究,发现其最适pH为8.0,最适温度为45℃,并且在温度低于35℃时具有良好的稳定性,Km值为0.458 mmol·L-1,kcat为2.438 min-1。底物谱研究表明,与已研究报道的P450SMO,P450Labr,P450-Hal1等相似,P450VpMO不仅可以氧化硫醚,催化苯乙烯,还可以对多种含烷基底物进行脱烷基化的反应。底物谱结果显示相比于硫醚的氧化和苯乙烯的催化,P450VpMOpMO O-脱烷基的反应活性最高,其中对4’-甲氧基苯乙酮的脱甲基反应转化率高达91%。另外,进一步研究发现重组P450VpMO还可以降解含甲氧基的抗生素污染物甲氧苄胺嘧啶。综上研究表明,P450VpMO是细胞色素P450单加氧酶家族一种电子自供体类型的新型P450酶,具有较高的电子传递效率,可以催化多种不同的反应类型是合成生物学重要的酶元件,具有极高的应用价值。