论文部分内容阅读
背景:成纤维细胞的异常增生或胶原蛋白的代谢异常是病理性瘢痕和纤维化疾病致病原因之一。目前因其在治疗及预防方面尚缺乏有效办法，困扰着医生及患者。沙利度胺，最初于1956年前联邦德国用于失眠症及妊娠反应，不久便风靡欧洲，但因其明显致畸作用而于1961年被限制使用并退出市场。1965年以色列皮肤病学家Sheski发现其可以迅速控制及改善麻风病人病情，从而开创了沙利度胺在皮肤科疾病中应用的先河，而后国内外的研究也已证实沙利度胺通过抑制VEGF及TNF-a而产生有抗血管生成、抗炎、抗肿瘤及免疫调节的作用，而被广泛应用于风湿免疫、血液疾病及一些难治性皮肤病，并且已有学者研究表明沙利度胺通过抑制炎症因子活性通路而产生具有抑制肝纤维化、肺纤维化及通过干扰p38/Smad3通路从而抑制正常及瘢痕疙瘩成纤维细胞纤连蛋白的生成[1]。但关于沙利度胺直接作用于真皮成纤维细胞，对其细胞凋亡相关基因的研究甚少。细胞凋亡的研究是当今生命科学中最为活跃的领域之一，其中Caspase-3、Bcl-2及BAX的研究为凋亡因子热点，Caspase-3是细胞凋亡的执行者，对细胞凋亡起促进作用，而Bcl-2及BAX通过形成同源或异源二聚体而调控细胞的凋亡，当Bcl-2表达增多时，表现凋亡抑制，而当BAX表达增多时，则促进细胞凋亡。因此本课题通过研究沙利度胺对正常人真皮成纤维细胞中凋亡相关基因Caspase-3及Bcl-2/BAX mRNA表达的影响，从而为开发沙利度胺在皮肤科，尤其是成纤维细胞相关疾病的临床应用及关于其在细胞凋亡方面更进一步的研究提供可靠的参考依据。 目的:探索沙利度胺直接作用于正常人真皮成纤维细胞对凋亡相关基因Caspase-3及Bcl-2、BAX mRNA表达的影响。 方法: 1、使用含体积分数20％胎牛血清的DMEM培养基，通过消化-组织块混合法进行人真皮成纤维细胞原代培养。 2、波形蛋白免疫组化染色，进行细胞鉴定。 3、传代后取第5代细胞进行荧光定量PCR测定凋亡相关因子(Caspase-3、Bcl-2、BAX) mRNA的表达情况。成纤维细胞经传代后随机分为5组，分别加入0（对照组）、10-4 mol/L（-4组），10-5 mol/L(-5组)，10-6 mol/L（-6组），10-7mol/L（-7组）含沙利度胺的培养基，每组设三个样本。均接种在25mL培养瓶中继续培养，24h后提取各组总RNA。应用荧光定量PCR对Caspase-3、Bcl-2、BAXmRNA的表达量进行测定。 4、统计学分析:采用SPSS15.0统计学软件对实验数据进行统计处理，实验数据首先经正态性检验，符合正态分布的可采用单因素方差分析，否则按照非参数检验中的Mann-Whitney检验，P＜0.05有统计学意义。 结果: 1、成功培养人真皮成纤维细胞，形态学观察细胞呈长梭形，呈束状或旋涡状排布于瓶底。 2、免疫组化对所培养细胞鉴定，结果显示:波形蛋白(Vimentin)阳性，为人皮肤成纤维细胞。 3、Caspase-3 mRNA表达水平测定 RQ值（对照组）:0.976±0.007（-4组:）1.165±0.053（-5组）:2.756±0.029(-6组):1.131±0.040（-7组）:1.125±0.043。Caspase-3 mRNA在10-5mol/L浓度沙利度胺刺激下表达高于对照组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。其余各沙利度胺浓度组差异无统计学意义(P＞0.05)。提示10-5mol/L浓度沙利度胺可促进入真皮成纤维细胞Caspase-3 mRNA的表达。 4、Bcl-2 mRNA表达水平测定 RQ值（对照组）:0.941±0.034（-4组）:0.385±0.009（-5组）:0.713±0.030(-6组):0.928±0.011(-7组):0.958±0.022。 Bcl-2 mRNA在10-4mol/L及10-5mol/L浓度组中的表达低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），且两试验组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，10-4mol/L组中RNA的表达低于10-5mol/L组。其余两组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。提示10-4mol/L及10-5mol/L浓度沙利度胺可抑制人真皮成纤维细胞Bcl-2 mRNA的表达。 5、BAX mRNA表达水平测定 RQ值（对照组）:0.997±0.007(-4组):1.343±0.039(-5组):1.280±0.023（-6组）:0.968±0.018(-7组):1.050±0.065。BAX-mRNA在10-4及10-5mol/L浓度组中的表达高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，但两试验组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。其余两组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。提示10-4mol/L及10-5mol/L浓度沙利度胺可促进人真皮成纤维细胞BAX mRNA的表达。 结论:沙利度胺在10-5mol/L浓度作用下，直接作用人真皮成纤维细胞可升高Caspase-3及BAX mRNA的表达，同时降低Bcl-2 mRNA的表达;而在10-4mol/L浓度下仅对Bcl-2及BAX mRNA表达产生上述影响，说明一定浓度的沙利度胺直接作用人真皮成纤维细胞可促进三个凋亡相关因子mRNA促凋亡表达。