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第一部分蛛网膜下腔出血后RIP3的蛋白水平及分布变化目的:研究大鼠蛛网膜下腔出血(SAH)后脑组织中RIP3蛋白水平及分布的变化;坏死性凋亡的水平及机制。方法:选择48只SD大鼠随机分为假手术组和SAH后3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、7天共8组,每组SD大鼠6只。所有的大鼠在SAH后对应的时间点被处死。取各组大鼠双侧颞底脑组织,利用免疫荧光和Western blot技术分析检测RIP3的蛋白水平及分布情况,利用PI染色技术分析坏死性凋亡的水平,利用免疫共沉淀技术分析坏死性凋亡的机制。结果:1、大鼠SAH后脑组织内的RIP3水平呈先上升后下降的变化,以SAH后24h组RIP3蛋白水平上升最为显著(P<0.05);2、体内免疫荧光结果显示RIP3在SAH后24h细胞内的定位明显升高。3、大鼠SAH后脑组织内PI阳性细胞增多。结论:SAH后RIP3的表达水平在24h明显升高;SAH后脑组织内坏死性凋亡增多。第二部分 调控RIP3对蛛网膜下腔出血后脑损伤的影响目的:探索通过 RIP3 抑制剂(GSK872)、TNF-α 抑制剂(TNF-α inhibitor)、RIP3质粒和小干扰RNA的干预后RIP3、MLKL在蛛网膜下腔出血后的表达和磷酸化情况,以及其发生的变化在大鼠SAH后损伤中所起的作用。方法:随机选取180只SD大鼠,分为以下10组:假手术组、SAH组、SAH+Vehicle组、SAH+GSK872 组、SAH+TNF-α inhibitor组、SAH+GSK872+TNF-α inhibitor 组、SAH+Si-NC 组、SAH+Si-RIP3 组、SAH+Vector 组和 SAH+Over-RIP3 组,每组 18只。在干预GSK872、TNF-α inhibitor和转染RIP3质粒与小干扰RNA后48h造模。在SAH后24h后进行神经功能评分,取其双侧颞底脑组织进行Western blot分析、免疫共沉淀、PI染色,取其脑脊液进行ELISA(TNF-α)实验。结果:1.药理干预可减轻RIP3和MLKL磷酸化的增加,抑制SAH所致的脑损伤。2.基因敲除可减轻SAH大鼠脑损伤。3.RIP3上调后脑脊液中TNF-α水平升高,抑制RIP3后下降。4.化学抑制剂和基因敲除抑制RIP3改善SAH后神经认知功能。结论:RIP3蛋白水平的升高可一定程度上加重蛛网膜下腔出血早期脑损伤,而RIP3蛋白水平的下降在很大程度上能减轻脑损伤。第三部分RIP3在蛛网膜下腔出血后体外神经元内所起的作用及其在坏死性凋亡的作用目的:通过GSK872干预原代神经元后检测RIP3、MLKL的磷酸化,并在体外验证坏死性凋亡的作用机制。方法:培养原代神经元细胞,将其分为以下8组:正常对照组、Condition Medium、Condition Medium+Vehicle、Condition Medium+GSK872,通过 Western blot、免疫共沉淀实验方法检测坏死性凋亡的机制以及RIP1、MLKL的磷酸化的表达。结果:Western blot、免疫共沉淀结果示:1.条件培养基刺激后,神经元中RIP3与RIP1、RIP3、MLKL的相互作用均较对照组明显增强。2.条件培养基组RIP3磷酸化水平明显高于对照组。条件培养基+GSK872组RIP3磷酸化水平明显低于条件培养基+Vehicle组。3.条件培养基组MLKL磷酸化水平明显高于对照组。条件培养基+GSK872组MLKL磷酸化水平明显低于条件培养基+Vehicle组结论:GSK872对RIP3和MLKL磷酸化有抑制作用。