研究背景人类CD99是一个分子量32kDa的糖基化跨膜蛋白,由位于X和Y染色体短臂假染色体区（PAR, Xp22.32-pter和Yp11-pter）的MIC2基因所编码,其功能至今未明确。近年来研究发现在人类骨髓、胸腺及外周血中的细胞均有CD99的表达,而且表达的水平与细胞的成熟程度密切相关,未成熟的细胞要高于成熟细胞。CD99在未成熟血细胞高表达现象是否提示它在血细胞的分化、发育的过程中起重要的调控作用?与哪些调控因子相关?怎样的调控机制?这些问题引起了我们极大兴趣。造血过程是各种血细胞的分化、发育、成熟的过程,是一个多阶段、多步骤、受多种因子调控的复杂而有序的动态过程。已有证据表明人和小鼠的成体造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）是成体内各系造血细胞的来源,单个HSC即可在合适的宿主体内重建整个造血系统。人类造血干细胞增殖分化是按照严格的等级制度进行的,并受不同的造血生长调控因子调控。首先由多能造血干细胞自我增殖后,一支向淋系造血祖细胞（common lymphoid progenitor,CLP）分化,随后分化成熟成为外周淋巴细胞；另一支向髓系造血祖细胞（commonmyeloid progenitors, CMP）发育成熟为外周血细胞如粒细胞、单核细胞、红细胞和血小板。尽管人类对造血的起源、分化、发育、增殖、成熟等过程进行了大量的研究,至今未获得人类造血干细胞形态学的直接证据,对这些调控机制更是不甚明确。小鼠是公认最好的模式生物之一,但由于它是胚胎子宫内发育,难以对早期造血进行快速连续的观察,因此一定程度限制了在早期胚胎造血领域的研究。近年来,一种叫斑马鱼（zebrafish or Danio rerio）的模式生物迅速吸引了全世界大批实验室和科学家。它与人类基因组同源性高,血细胞组份与人类相似,同样具有红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞及血小板,其造血过程高度保守,与高等脊椎动物具有一致性：（1）造血过程一致性,均包含原始造血和定向造血两个过程；（2）调节区域基本一致,具有相似的造血区域；（3）信号通路方面也具有一致性。与小鼠相比它体外受精、体外发育、透明可视、胚胎容易获得,因此非常适合作为研究早期胚胎造血的模式生物。为此本研究以斑马鱼作为模式生物,探究斑马鱼cd99l2（Danio rerio CD99 antigen-like 2, NM₁94369）在斑马鱼血细胞的分化、发育的过程中作用,为探索人类CD99在造血过程的功能提供线索。人类CD99在斑马鱼的直系同源基因（Orthology） cd99l2的跨膜区域氨基酸序列与人类CD99有着58%的一致性和98%的相似性,因此通过研究斑马鱼cd99l2的功能来揭示人类CD99在血细胞的分化、发育过程的功能成为了可能。为研究cd99l2在斑马鱼造血的功能,首先要熟悉胚胎发育过程中cd99l2基因表达的时间及位置。由于目前尚无商品化的cd99l2抗体,我们无法从检测cd99l2的蛋白入手,为此我们采用整体原位杂交技术（whole-mount in situ hybridization, WISH）检测cd99l2在转录水平的表达,该杂交技术不同于一般在载片上对细胞和组织切片进行杂交,而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测,在整体水平上精确地观测胚胎发育过程中基因表达的三维信息。与切片杂交相比,其最大的特点在于整体性,它可以较直观全面地看到基因的表达部位。因为WISH是检测整个胚胎,包含了相应阶段所有的转录子,对探针长度的要求较高,为了保证杂交的特异性,我们采用体外转录的方式自行制备地高辛标记的反义cd99l2探针。在探针的有效性得到保证后,采用WISH技术连续观测了cd99l2的时空表达,发现了一个新的信号区域,经分析可能是早期造血的部位,于是引入3个与造血密切相关的突变体cloche, scl和moonshine,探究cd99l2时空表达与早期造血的关系。cloche的突变体,该突变体是某一基因突变后导致cloche突变体纯合子很早期即发生严重的造血缺陷,几乎没有任何的血细胞,同时成血管细胞（angioblast）消失、血管形成障碍。scl的突变体,该突变体是干细胞白血病基因（Stem cell leukemia, SCL）突变所致,该基因在造血过程中具有极为重要的作用,它的突变直接导致scl突变体纯合子发生严重的造血缺陷,几乎不生成任何的血细胞,同时血管形成障碍,但其成血管细胞存在。moonshine的突变体,该突变体为造血较晚期的调控基因mon发生了突变,出现原始及永久造血中红系缺失,而其他谱系及血管生成均正常。我们分别验证了3个突变体的各谱系的造血情况,包括红系（βe1,O-dianisidine染色）、髓系（lyc,苏丹黑染色）、淋系（ragl）、血管及成血管细胞（flil）的检测,利用三个突变体在不同阶段的造血障碍,分析cd99l2与斑马鱼早期造血的关系。本研究通过以下三部分进行：第一部分地高辛标记斑马鱼cd99l2基因RNA探针的制备1.目的：制备用于检测斑马鱼胚胎早期cd99l2基因时空表达的地高辛标记RNA探针。2.方法：设计引物,构建cd99l2/pGM-T重组质粒,用SacⅡ酶切得到线性化DNA片段,以Sp6 RNA聚合酶体外转录合成地反义地高辛标记的RNA探针,采用WISH检测斑马鱼胚胎早期cd99l2基因的表达,验证探针的有效性。3.结果：成功地构建了cd99l2/pGM-T重组质粒,并体外转录获得反义RNA探针。4.结论：本章节制备的反义cd99l2 RNA探针,由于其长度达600bp以上,带有上百个地高辛,因此具有较高的特异性,较弱的表达也能有效检测。第二部分cd99l2在胚胎发育过程中时空表达模式的研究1.目的：通过不同时间和不同部位表达的变化,在整体水平上构建胚胎发育过程中cd99l2基因表达的三维结构,为后续研究该基因的功能提供信息。2.方法：收集各个时期的胚胎,WISH检测cd99l2基因的mRNA的时空表达。3.结果：成功构建cd99l2时空表达模式,除了与文献报道的在中枢神经系统高表达之外,我们发现了新的与ICM造血区域相似的表达区域。4.结论：新发现的表达信号可能为造血区域中某种细胞或其前体细胞,也可能是成血管细胞。第三部分斑马鱼cd99l2与胚胎早期造血关系的研究1.目的：明确cd99l2在斑马鱼胚胎早期造血中的意义。2.方法：利用cloche、scl、moonshine3个突变体验证cd99l2与早期造血关系。3.结果：cloche、scl、moonshine突变体纯合子中cd99l2的信号消失。4.结论：通过与红细胞特异性标记βel时空表达比对,并通过3个突变体证实cd99l2仅参与了原始红系造血过程。