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研究背景上皮细胞与内皮细胞、成纤维细胞、神经内分泌细胞、炎性细胞、细胞外基质等构成组织微环境,细胞间的相互作用可调控细胞的增值、分化、凋亡、分泌活化的可溶性因子及细胞外基质组份,这些组份的协调使细胞和组织达到动态平衡。但是在肿瘤微环境中[1],这些细胞可以被肿瘤细胞诱导,在其周围产生大量的生长因子、细胞趋化因子、基质降解酶等,从而有利于肿瘤细胞的增殖和侵袭。肝星型细胞(Hepatic stellate cell HSC)是重要的肝基质细胞,肝癌细胞可诱导HSC活化,而活化的HSC又可促进肝细胞癌(Hepatic carcinoma HCC)的浸润和转移。本研究拟了解肝癌细胞与HSC的相互作用对HCC转移的影响。NDRG2属于NDRG家族,被定义为抑癌候选基因的它可在许多正常组织中表达。最近的许多研究表明NDRG2除了能抑制肿瘤增值,增加细胞凋亡外,还能抑制肿瘤转移。有研究表明NDRG2表达缺失可引起HCC具有高转移潜力和不良预后,针对100例肝癌患者的免疫组化提示NDRG2降低与淋巴结转移、肿瘤分化程度、门静脉栓塞、肿瘤浸润生长方式及肿瘤复发相关,将肝癌细胞系转染NDRG2后可明显抑制其浸润及转移能力。NDRG2过表达可抑制由TGF-β1引起的肝癌细胞MMP-2及PAI-1表达的增加,从而抑制肿瘤转移。乳腺癌细胞系中过表达NDRG2可诱导BMP4抑制MMP9表达,从而使乳腺癌细胞侵袭及转移能力下降。另外在侵袭性脑膜瘤、黑色素瘤和大肠癌鼠模型中亦发现NDRG2能够抑制肿瘤转移。HCC引起高复发、高转移的特性一直是肿瘤治疗的难点,NDRG2在其转移中的机制研究十分重要。已有文献提示NDRG2与MMPs间具有一定相关性,这引起我们对NDRG2是否参与了分泌MMPs的重要间质细胞HSC活化的兴趣。CD44是细胞膜上广泛表达的糖蛋白,在细胞与细胞、细胞与基质间作用、淋巴细胞归巢以及肿瘤转移中起重要作用。CD44与透明质酸(hyaluronic acid HA)结合可调节肿瘤细胞的运动信号。通过有效手段抑制CD44可降低肿瘤细胞的侵袭及转移能力。CD24是与P选择素结合的粘附分子与肿瘤生长和转移相关,CD24通过活化alpha3beta1和alpha4beta1整合素促进肿瘤细胞增值及增强对纤连蛋白、I和IV型胶原、层粘连蛋白的粘附,CD24表达会促进细胞快速播散、运动及侵袭。同时HSC活化也会引起粘附分子的表达变化,所以我们也想进一步明确NDRG2是否参与对肝癌细胞及HSC的粘附分子表达调控。目的和内容:研究NDRG2与HCC转移相关粘附分子间的作用机制,研究NDRG2是否参与HSC的相关活化基因调节和对粘附分子的表达调控,进一步了解NDRG2是否也参与了HSC的活化与肝癌细胞间的相互作用及对肝癌转移的影响。方法:1)运用RT-PCR及Western blot方法检测不同转移能力肝癌细胞系的NDRG2表达;通过划痕、侵袭、粘附实验观察不同转移能力细胞系的迁移、侵袭、粘附能力;运用NDRG2基因的重组腺病毒及siRNA感染和转染肝癌细胞系使NDRG2过表达或下调后,观察细胞迁移、侵袭、粘附能力的改变。2)运用NDRG2基因的重组腺病毒及siRNA感染和转染肝癌细胞后,通过Real Time PCR观察转移相关粘附分子的改变,进一步通过Weatern blot检测蛋白水平的改变。3)继续运用NDRG2基因的重组腺病毒及siRNA感染和转染肝星形细胞系LX2后,通过Real Time PCR观察HSC活化相关分子的改变,进一步通过Weatern blot检测蛋白水平的改变。4)建立体外肝癌细胞与HSC的胶内共培养模型和裸鼠荷瘤三维共培养模型,给予NDRG2干扰后,通过HE染色及免疫组化等实验技术观察两细胞间的粘附、趋化性及相应基因的改变。结果:1)NDRG2随肝癌细胞系转移能力的增强而减弱,细胞迁移、侵袭、粘附能力随NDRG2表达增高而减弱,进一步过表达NDRG2可观察到细胞迁移、侵袭、粘附能力的减弱,下调NDRG2可观察到细胞迁移、侵袭、粘附能力的增强。2)过表达NDRG2可观察到粘附分子CD44、CD24在mRNA及蛋白水平的表达减弱;下调NDRG2可观察到粘附分子CD44、CD24在mRNA及蛋白水平的增强;在肝癌患者癌组织病理切片免疫组化也提示NDRG2减低及CD44和CD24表达增高。3)HSC中NDRG2过表达后,HSC活化相关基因α-SMA、CD44在mRNA及蛋白水平表达减弱,同时细胞的侵袭能力减弱;下调HSC上的NDRG2表达可使α-SMA、CD44表达增加。4)通过肝癌细胞和HSC的共培养模型,发现肝癌细胞过表达NDRG2后减弱了它们对HSC的趋化、粘附;下调肝癌细胞上的NDRG2增加了它们对HSC的趋化、粘附。过表达HSC上的NDRG2使得α-SMA、CD44表达减弱;同时发现过表达NDRG2可使TGF-β1作用HSC后增加的CD44的配体透明质酸含量降低。结论:在HCC微环境中NDRG2具有重要的调节作用,NDRG2的过表达和下调会引起肝癌细胞上CD44、CD24表达的相应减弱及增强,会引起HSC活化基因α-SMA、CD44等的相应减弱及增强。NDRG2过表达可减弱TGF-β1诱导的细胞透明质酸的增加。进一步影响两种细胞间的粘附、趋化作用而调控转移。