【摘 要】
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2006年夏季我国出现了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)其主要特征是编码Nsp2蛋白的基因发生了90个碱基的缺失,
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2006年夏季我国出现了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)其主要特征是编码Nsp2蛋白的基因发生了90个碱基的缺失,且不同地区的缺失分离株具有高度的同源性。具有该特征的PRRSV被认为是导致2006年猪高热病病猪大批死亡的原因。为确认具有该基因特征的PRRSV的致病性,本研究选取具有时间代表性的PRRSV/Changzhou/2005、PRRSV/JSyx/2006和PRRSV/Yangzhou/2008株进行生物学特性研究和基因组全序列测定,比较其毒力与序列方面的相关性。3株病毒感染Marc-145细胞能够产生相同的细胞病变,特异的Nsp2引物进行RT-PCR,PRRSV/JSyx/2006/株和PRRSV/Yangzhou/2008株均为Nsp2缺失毒株;测序发现PRRSV/Changzhou/2005毒株为Nsp2缺失3个碱基毒株。动物回归试验表明,PRRSV/JSyx/2006和PRRSV/Yangzhou/2008株能够引起试验仔猪产生皮肤发绀等典型的PRRS病变,比PRRSV/Changzhou/2005株攻毒猪的病变严重;且体温升高的幅度和发热维持的时间也比后者明显。尽管Nsp2缺失株攻毒猪产生明显的病变以及体温升高,在发热期间食欲有所下降,但试验猪体表病变在攻毒后20 d左右均结痂脱落,且体温在攻毒后10 d左右恢复正常,未出现猪的死亡。根据GenBank中已发表的PRRSV保守序列,设计了基因组全序列扩增引物,对这3株病毒进行基因组全序列测定,并与GenBank中已发表序列进行对比分析。通过全基因组的比对,发现PRRSV/JSyx/2006株和PRRSV/Yangzhou/2008株编码Nsp2蛋白区域均有90个碱基的不连续缺失,分别在基因组第2778～2780位缺失了3个碱基(编码一个苯丙氨酸)和在2947～3033位缺失了87个碱基(编码27个氨基酸)。值得注意的是PRRSV/Changzhou/2005株Nsp2的区域上述位点只有3个碱基的缺失。通过分子发生树分析,我国大陆分离株明显分为两个分支,CH-1a、HB-1、PRRSV/Changzhou/2005、PRRSV/JSyx/2006和PRRSV/Yangzhou/2008株同属一个分支,且PRRSV/JSyx/2006和PRRSV/Yangzhou/2008株与其他省份分离的变异株具有高度的同源性,其碱基突变位点一致。本研究在全基因组序列测定的基础上,根据相应酶切位点设计8对引物,利用RT-PCR方法扩增出覆盖PRRSV/JSyx/2006株基因组的8个cDNA片段,分步将全长cDNA克隆入pCR(?)2.1载体,最终通过酶切将含有PRRSV/JSyx/2006株全长cDNA的片段克隆到pCMVmc1载体中,完成PRRSV/JSyx/2006基因组全长感染性cDNA克隆pCMV-PRRSV/JSyx/2006的构建,通过转染Marc-145细胞,获得了拯救病毒。
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