论文部分内容阅读
延缓华勒氏变性(slow Wallerian degeneration, Wlds)突变小鼠最早是被发现可以延缓神经元华勒氏变性,后来研究发现Wlds基因产物是一种融合蛋白,包括N端70个氨基酸组成的泛素化组装因子(ubiquitination assembly factor, Ube4b),C端合成NAD的关键酶烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶(nicotinamide mononucleotide adenylyl transferasel, Nmnatl),以及中间18个氨基酸的连接蛋白。研究证实该种基因突变小鼠的神经保护功能主要是由Nmnatl介导的,由于是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)合成的关键酶,因此,一些学者推测NAD可能参与神经变性,并开始进行实验研究NAD对神经的保护作用,结果发现NAD与神经损伤密切相关。糖尿病(diabetes mellitus, DM)是最常见的慢性病之一。随着人们生活水平的提高,人口老龄化以及肥胖发生率的增加,糖尿病的发病率呈逐年上升趋势。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常见的严重并发症之一,是导致视力下降的主要原因。糖尿病引起视网膜病变的发病机理主要是山梨醇旁路活性的增加以及微血管的病变。近期一些研究表明在组织学出现血管异常之前已经有视网膜组织代谢功能的损害。当血糖含量增高,山梨醇途径明显激活,代谢过程中,会消耗NAD,导致细胞内NAD及NAD/NADH比值下降。同时,最近研究表明糖尿病患者的视网膜活性氧增多导致细胞DNA损伤,DNA修复酶聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)被明显激活,进一步导致NAD的耗竭,NAD/NADH降低,从而阻碍细胞内ATP生成,能量代谢紊乱,以及与NAD相关的靶蛋白的功能异常,最终引起细胞死亡,视功能下降。因此,本文工作应用Wlds突变小鼠,在建立Ⅰ型糖尿病视网膜病变模型的基础上,观察Wlds可否通过改善NAD/NADH比值延缓糖尿病对视网膜功能和神经节细胞存活的损害,为糖尿病视网膜病变的发生机制积累学术基础,同时为印证Wlds基因的神经保护机制提供理论依据,并为治疗人类眼科相关疾病提供新的策略。目的：研究W1ds基因对于糖尿病视网膜病变的影响。方法：实验动物选取C57BL/6J和Wlds雄性小鼠,4周龄鉴定基因型,1)Ⅰ型糖尿病模型的建立：小鼠8-10周龄时称量体重,以150mg/Kg剂量空腹腹腔注射链脲霉素STZ,单次大剂量损伤胰岛B细胞,未造模对照组腹腔注射柠檬酸钠缓冲液,隔周监测注药后小鼠空腹血糖、体重以及存活率,血糖>11.2mmol/L即认为造模成功。小鼠分为四组,分别为C57BL/6J小鼠(wt),STZ诱导的糖尿病C57BL/6J小鼠(wt+stz), Wlds小鼠(Wlds)和STZ诱导糖尿病Wl ds小鼠(Wlds+stz):2)图形视网膜电图(Pattern-Electroretinogram, pERG)检测：pERG检测四组小鼠的视网膜功能；3)病理学石蜡切片HE染色对四组小鼠的视网膜神经节细胞层(retinal gonglion cell layer, RGCL)细胞进行形态学和细胞全层计数定量评价；4)免疫组织化学：运用活性神经节细胞(retinal gonglion cell, RGC)特异性标志物微管蛋白(Neuronal Class III p-Tubulin, TUJ-1),统计有活性神经节细胞在各组的数量；5) NAD/NADH匕值测定：分别测定四组小鼠视网膜中NAD/NADH匕值。结果：1)C57BL/6J和Wlds小鼠在空腹腹腔注射STZ后均出现空腹血糖值明显升高,体重下降,造模两组小鼠血糖及体重相较无明显差异,但Wlds相对于C57BL/6J小鼠的生存率高；2)生理状态下C57BL/6J和Wlds小鼠的pERG、视网膜形态学、神经节细胞层细胞数量、RGC数量以及NAD/NADH均无明显差异；3)pERG检测：Wlds+stz组小鼠相对于wt+stz组p50的波峰值降低幅度较小,提示wt+stz组视网膜神经传导功能明显受损；4)组织学检测：与对照组相比,STZ造模后wt小鼠神经节细胞层细胞数量以及有活性的神经节细胞数量显著减少,而WldS小鼠无明显改变。5)同Wlds+stz组小鼠相比,wt+stz组小鼠视网膜NAD/NADH比值下降更为显著。结论：Wlds相对于C57BL/6J小鼠对糖尿病视网膜病变具有较强的保护性作用,其作用机制可能是通过上调Wlds蛋白产物NAD合成酶Nmnatl,缓解糖尿病视网膜NAD下降,延缓NAD及NAD/NADH相关的细胞生化代谢反应和细胞内能量耗竭,对视网膜神经节细胞起到保护作用,稳定视功能,从而对糖尿病视网膜病变起到保护性作用。综上所述,本研究工作的创新之处在于：应用Wlds小鼠和C57BL/6J小鼠,研究Wlds在糖尿病视网膜病变中的作用,获得Wlds发挥神经保护作用的直接证据；研究结果提示W1ds可能通过调节糖尿病视网膜细胞NAD/NADH比值,稳定细胞能量代谢,调节NAD相关作用元件,减少视网膜神经节细胞的死亡,参与视网膜的保护,为糖尿病视网膜的治疗提供新的学术研究方向。