本试验于2001～2003年在山东农业大学园艺学院、山东省葡萄酿酒研究所、东营市林业局苗圃中进行，以转甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因的宝石无核葡萄和红球葡萄为试材，建立快繁体系，利用抗生素筛选、GUS基因染色以及PCR进行特定基因克隆等方法对转化效果进行鉴定，同时利用组织培养、盆栽和水培的方法对转基因葡萄的耐盐性和耐碱性进行研究，以及在生理、形态方面进行测定与观察，主要结果如下： 1．建立了转BADH基因宝石无核、红球葡萄的快繁体系。筛选出分化、伸长、生根的一系列培养基。分化培养基以B₅+6-BA0.4mg.1^-1为最佳，分化苗多、芽头密度高、叶色绿；伸长培养基以B₅+KT3.0mg.1^-1+NAA0.1mg.1^-1为最佳，苗子伸长现象明显、粗壮；生根培养基以B₅+IAA0.4mg.1^-1为最佳，7天后开始生根，生根数量多，粗壮；简化组培生根结果也表明，IAA效果好，苗子生长旺盛，侧根数目多，移栽易于成活。 2．转基因葡萄的鉴定： （1） 在分化培养基上，利用抗生素进行筛选，在含50mg.1^-1卡那霉素的条件下培养50天，转化植株生长较为正常，而对照大部分白化死亡。 （2） 利用GUS基因染色液进行染色，转化植株染成深蓝色而对照没变化。 （3） 对于经过卡那霉素初步筛选获得的宝石无核、红球葡萄转化植株利用PCR进行特定基因克隆。宝石无核共检测6株，有4株有约1.5Kb的特异带产生。红球共检测5株，有4株有约1.5Kb的特异带产生。对于经过检测获得的转化植株，进行再次检测，宝石无核和红球各取3株，都有约1.5Kb的特异带产生。对于红球转化植株进行BADH基因3’端克隆，检测5株，有两株有约300bp的特异带产生。同时对经过PCR检测获得的一株红球转化植株进行3’端和结构基因的克隆，有两条特异带产生。 3．在组织培养、盆栽和水培条件下，对转基因葡萄进行耐盐性和耐碱性鉴定，结果如下： （1） 在组织培养条件下，随着盐分梯度的提高，在分化培养基上，转基因葡萄的始分化天数逐渐延长，分化率、芽头密度逐渐降低，生长势逐渐减弱，死亡率逐渐升高，在5‰盐分梯度以下转基因葡萄生长表现正常，而对照只有在3‰盐分梯度以下生长表现较为正常。在生根培养基上，始生 刘建强；转甜菜碱醛脱氢酶基因葡萄品种的鉴定 根天数逐渐延长，I级根平均日变化，平均根条数逐渐降低，生长势逐渐 减弱，死亡率逐渐升高；生根培养叨天后，l级植株平均苗高和1级根 平均根长在总体上逐渐下降，叶绿素含量逐渐降低，在5％。盐分梯度以下 转基因葡萄生长表现较好。 （2） 在组织培养条件下，进行耐碱试验，结果表明：转基因葡萄在始分化 天数、芽头密度、死亡率、生根率、1级根平均日变化、l级植株平均苗 高以及生理形态指标等方面与对照差别不大，说明转基因葡萄耐碱性不明 显。·在所有的碱度之内转基因葡萄在各个指标的表现差异不明显，说明碱 胁迫不是盐碱地栽植困难的主要限制因子。 门)在盆栽条件下检测转基因葡萄的耐盐碱性差异，结果显示： 在盐碱土上，转基因葡萄可以在含盐量 5输时生长，而无明显的盐害 症状，生长势中等，在含盐量7％条件下转基因葡萄仍能够存活，但表现出 较为明显的盐害症状。在浇灌不同浓度NaCI的土壤上，转基因葡萄植株移 栽成活率为100人 在1％厂4％删aCL范围内均有不同程度的生长，在 5％ON沈L以上，转化植株生长不明显，叶缘白化。 （4）在水培条件下，转基因葡萄在4％。盐分梯度以下生长表现正常，在 5％。处理下表现出轻度的受害状，而对照只有在2％。处理下生长表现正常。 在不同盐处理浓度下，转基因葡萄开始出现盐害的时间存在差异。在1％0 处理下20天左右出现盐害症状，而在7％。条件下，只有6天就出现盐害 症状。在盐胁迫下，转基因葡萄的质膜透性发生不同程度的增加，5％。处 理下出现高峰，从6hi处理以上，质膜透性有较大幅度下降，在一定程度 表明转基因葡萄对盐的耐受性降低。随着盐分梯度的提高，转基因葡萄的 叶绿素含量逐渐下降，从4％0到5％叶绿素含量发生较大程度的下降。 4．对转基因葡萄和对照的各项生理指标进行测定，结果如下：· 对转基因宝石无核葡萄相对电导率和大分子渗漏值的测定结果表明 转化植株的相对电导率和大分子渗漏值与对照相比明显较低；对转基因红 球葡萄的测定结果亦是如此。对气孔密度的差异性分析表明，对照与转基 因葡萄之间在0．05水平上差异显著，在0．of水平上差异极显著，气孔数 量少，减少蒸腾作用，有助于在盐胁迫下的存活及生长。