论文部分内容阅读
鱼肉蛋白营养价值丰富,其主要的肌球蛋白具有良好的功能特性,如凝胶性、持水性、乳化性等。但是由于天然鱼肉肌球蛋白质构过于柔软细腻,极易发生变性,导致功能特性急剧下降,极大限制了鱼肉肌球蛋白的加工和应用。为改善肌球蛋白的功能特性,可以对其进行修饰改性。基于Maillard反应机理糖基化反应是蛋白质改性方法中的一种绿色有效的方法,具有操作简单、无化学添加、显著改善蛋白质功能性质的优点。本论文以鲢鱼肌球蛋白(myosin protein,Ms)和魔芋寡糖(konjac oligo-glucomannan,KOG)为主要原料,对KOG进行脱乙酰基、羧甲基化和磷酸化改性,得到魔芋寡糖衍生物(modified konjac oligo-glucomannan,MKOG)。利用糖基化反应制备肌球蛋白-魔芋寡糖衍生物(Ms-MKOG)的糖基化修饰物,较为系统地研究了糖基化修饰物的理化、结构及功能特性,旨在研究糖供体的结构变化对肌球蛋白糖基化修饰物的影响,构建糖供体结构与糖基化修饰物功能特性之间的构效关系,丰富和完善糖基化反应理论,为食品蛋白的改性提供理论基础。三组KOG衍生物与肌球蛋白通过糖基化作用得到糖基化修饰物。测定了糖基化修饰物的理化性质,包括接枝度、自由氨基酸、SDS-PAGE、等电点、总巯基和氨基酸组成分析。结果表明,自由氨基酸含量显著降低(P<0.05),其中Ms-DKOG中自由氨基酸含量从Da0到Da5逐渐减少,而Ms-CMKOG和Ms-PKOG中自由氨基酸含量分别在CM1和PK0处最低;三组糖基化修饰物的赖氨酸与精氨酸的相对含量均明显降低(P<0.05),并且下降趋势与游离氨基酸的趋势一致;经改性后,糖基化修饰物的等电点均有不同程度的下降,其中Ms-PKOG的等电点下降程度不明显;总巯基减少程度明显,其中Ms-DKOG的总巯基从Da0到Da5逐渐增加,而Ms-CMKOG和Ms-PKOG的总巯基分别在CM0和PK5处最低。SDS-PAGE显示生成了高分子量的聚集体,其分子量的高低与糖基化修饰物的接枝度变化紧密相关。此外,傅里叶红外光谱证明了Ms以共价键形式引入了糖分子。通过SEM、AFM、红外光谱、圆二色光谱、差示扫描量热法、内源性荧光光谱、表面疏水性等分别测定了蛋白质的表观结构、一级结构、二级结构、亚基结构变性温度、三级结构以及四级结构的变化。结果发现,糖基化修饰物的表面疏水性较Ms都显著降低(P<0.05),其中Ms-DKOG糖基化修饰物的表面疏水性值比Ms-CMKOG和Ms-PKOG下降得多;二级结构中α-螺旋的相对含量降低,β-折叠和β-转角的相对含量降低,其中Ms-CMKOG和Ms-PKOG的α-螺旋结构减少量更加明显;不同的糖供体修饰肌球蛋白糖基化反应后,其变性温度不断升高;SEM和AFM结果显示蛋白解离和蛋白聚集作用同时发生,但以聚集作用为主,三种糖基化修饰物相较于Ms微观结构均有一定程度的变化,其中Ms-DKOG的变化最明显;内源荧光光谱表明,糖基化修饰物的最大发射波长会发生蓝移现象,Ms-CMKOG与Ms-PKOG由于淬灭剂的存在,荧光强度降低,说明糖基化会改变糖基化修饰物的结构,进一步改善蛋白质的功能性质。通过功能特性的研究发现,糖基化修饰物的溶解性(尤其是在高离子浓度盐溶液中)较Ms相比均有显著增加(P<0.05),其中Ms-DKOG的溶解性较高,Ms-PKOG的变化不明显;热稳定性较Ms也呈现显著增加的现象(P<0.05),其中Ms-DKOG的热稳定性升高最明显;与Ms相比,糖基化修饰物的乳化性能(包括乳化活性与乳化稳定性)均显著改善,其中Ms-DKOG的乳化性能最佳。利用基于人工神经网络方法建立了Ms及Ms-DKOG的体外消化的预测模型。利用Matlab的NNET工具包中的nftool建立神经网络模型。实验中选用了10个隐藏神经元,利用Levenberg-Marquardt算法迭代计算。结果表明,测试值与输出值的误差平均较小,拟合回归得到的整体R~2=0.9687,测试集合的R~2=0.99232,表明神经网络拟合效果较好,且具有一定的预测能力,可以很好地完成水解度预测的目标,选用的测试组的实验结果与神经网络输出值之间的误差均在±7%以内,说明此神经网络预测模型具有较高的预测能力和精度。