许多动物(包括脊椎动物和无脊椎动物)都使用血红蛋白来运输氧气,将氧气从肺、鳃或其他呼吸器官运送到需要氧气进行高效新陈代谢的周围组织。血红蛋白存在于高等生物体内的红细胞中,是血液不可缺少的成分,在生物体中发挥着重要功能。但是体内无血红蛋白的自然突变体-冰鱼的存在,为实验室构建血红蛋白缺失突变体提供了可能性。同为脊椎动物的斑马鱼和人类,其斑马鱼血红蛋白与人类血红蛋白有高度同源性,且斑马鱼自身有胚胎透明、产卵多、易于饲养等优势,是一种适合研究血红蛋白的发生发育的理想生物。目前已知的斑马鱼血红蛋白基因有多个,对于这些基因的研究可为由血红蛋白基因突变所引起的人类疾病提供一定的病理学知识。但是,迄今为止关于斑马鱼血红蛋白基因的研究少之又少。CRISPR/Cas9系统是从产脓链球菌的免疫防御系统改造得到的,该系统以构建简单,成本低廉,但效率高效等明显的优势脱颖而出,成为应用广泛的基因编辑技术。本研究主要目的是利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼血红蛋白基因家族中的hbae1.1基因,并研究缺失hbae1.1基因对斑马鱼血红蛋白生成的影响。其方法为:首先,根据斑马鱼hbae1.1基因设计靶点和检测引物,并制备出相应g RNA,将g RNA与Cas9蛋白以一定比例混合后通过显微注射注入斑马鱼受精卵一细胞期的动物极。取注射72h后的小鱼,通过T7E1酶切和基因测序技术检测靶点有效性。通过剪尾提取DNA、用检测引物PCR及T7E1酶切PCR产物,酶切出条带PCR产物即为筛选出的突变型F0代。将性成熟的突变体F0代与WT进行交配,提取受精卵基因组DNA,并进行测序,检测F0代斑马鱼是否可将突变成功遗传至后代。将可遗传的F0代斑马鱼与WT进行交配,经过筛选得到靶点处碱基缺失或增加个数为非3的倍数的F1代杂合子,将相同突变类型的成鱼F1代杂合子斑马鱼内交,经过筛选得到F2代纯合子。将F2代纯合突变体和WT斑马鱼各自所产受精卵置于28℃培养箱中进行培养。将培养48h后的受精卵进行固蓝(O-dianisidine)染色,观察胚胎血红蛋白的合成情况。本研究的结果有:成功制备了位于hbae1.1基因2号外显子的g RNA,检测出敲除靶点有较高敲除效率,成功筛选出靶点处发生移码突变的F1代,且F1代内交后,成功筛选出F2代纯合子。通过比较F2代纯合子和对照组WT斑马鱼各自所产受精卵的固蓝(O-dianisidine)染色情况,结果显示,与对照组WT相比,F2代纯合突变体的血红蛋白含量明显下降,表明胚胎时期hbae1.1基因的缺失会影响斑马鱼血红蛋白的生成。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9技术敲除hbae1.1基因,获得纯合突变体,成功建立了hbae1.1基因缺失的斑马鱼模型,并通过固蓝染色结果,表明hbae1.1基因的缺失会严重影响到斑马鱼血红蛋白的生成,这也说明hbae1.1基因在斑马鱼血红蛋白基因家族中有重要作用,这为鱼类血红蛋白的产生及发育过程的研究提供一定基础,同时也为与血红蛋白相关的人类疾病探究提供一定的研究基础。