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研究目的:评价滋水涵木利胆方治疗原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,PBC)的临床疗效,并观察滋水涵木利胆方对PBC患者外周血Th17细胞表达、相关细胞因子(IL-6、IL-17、IL-21、IL-23、TGF-β、Act1)水平和IL-17/Act1/NF-κB信号通路关键蛋白TRAF6、NF-κBp65、IκBα表达的影响,探讨滋水涵木利胆方治疗PBC可能的作用机制,为滋水涵木利胆方治疗PBC的临床运用提供实验依据。研究方法:1.临床研究部分:本课题采用随机、对照临床试验,共纳入76例肝肾阴虚型PBC患者,随机分为试验组和对照组,试验组接受滋水涵木利胆方联合熊去氧胆酸胶囊(Ursodeoxycholic acid,UDCA)治疗24周,对照组仅接受UDCA治疗24周。通过对试验组和对照组2种治疗方案24周的临床治疗,观察患者中医证候、肝功能、免疫球蛋白M(Ig M)、血清总胆固醇(TC)、肝纤维化血清学等指标的变化趋势。2.实验研究部分:入组的PBC患者,分别于治疗前及治疗24周后空腹抽血,应用流式细胞术(FCM)分析两组患者外周血Th17细胞表达比率的变化,酶联免疫吸附测定(ELISA)比较两组患者外周血清中IL-6、IL-17、IL-21、IL-23、TGF-β1和Act1水平,蛋白质印迹法(Western Blot)检测两组外周血TRAF6、NF-κBp65、IκBα蛋白表达,同时与正常健康组进行比较。应用Pearson相关性检验方法分析免疫指标与中医证候积分、GGT和ALP以及免疫指标之间的相关性。分析试验组和对照组PBC患者治疗前、后Th17细胞表达、相关细胞因子水平和IL-17/Act1/NF-κB信号通路关键蛋白表达的变化情况,以初步探讨滋水涵木利胆方治疗PBC可能的作用机制。研究结果:1.临床研究结果(1)临床有效率比较:试验组和对照组治疗24周后,FAS集分析:试验组有效率为84.21%,对照组为63.16%,差异有统计学意义(P<0.027)。FAS集与PPS集分析结果一致。(2)中医证候积分对比:试验组和对照组治疗24周后,组内对比均较治疗前积分明显下降;组间对比,试验组较对照组积分明显降低,差异有统计学意义,FAS集(P=0.014)。FAS集与PPS集分析结果一致。(3)生化指标对比:试验组和对照组分别在患者的四个时间点(治疗前和治疗后8周、16周、24周)进行了检测。结果显示:治疗24周后,试验组ALP、GGT、ALT水平较对照组明显降低,差异具有统计学意义,FAS集(P=0.000,P=0.001,P=0.036)。FAS集与PPS集分析结果一致。(4)肝纤维化指标对比:治疗24周后,试验组较对照组HA、CIV明显降低,差异有统计学意义(P=0.027,P=0.006),FAS集与PPS集分析结果一致。(5)TC对比:试验组和对照组在四个时间点(0周、8周、16周、24周)呈渐进性降低,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗24周后组间对比,试验组TC较对照组明显降低,差异有统计学意义(P=0.032)。FAS集与PPS集分析结果一致。(6)Ig M对比:治疗24周后,试验组较对照组Ig M水平显著下降,差异有统计学意义(P=0.010)。FAS集与PPS集分析结果一致。2.实验研究结果(1)PBC患者与健康组外周血Th17细胞表达比率对比:PBC患者的Th17细胞在外周血中表达比率明显高于健康组,有显著性差异(P<0.05)。相关性分析显示,Th17细胞表达比率与中医证候积分、GGT、ALP没有显著相关性。(2)PBC患者与健康组Th17相关细胞因子水平对比:PBC患者细胞因子IL-17、IL-6、IL-21、IL-23水平明显高于健康组,TGF-β1水平明显低于健康组,差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析发现,PBC患者血清中IL-6、IL-17、IL-21水平与中医证候积分有相关性(P<0.05),IL-17、IL-6、IL-21水平分别与PBC患者GGT水平呈正相关关系(P<0.05),IL-17、IL-21水平分别与PBC患者ALP水平呈正相关关系,Th17细胞表达比率与IL-17、IL-6水平呈正相关关系(P<0.05)。(3)PBC患者与健康组外周血IL-17/Act1/NF-κB信号通路主要成员对比:与健康组比较,PBC患者Act1水平升高,TRAF6、NF-κBp65蛋白表达量明显升高,IκBα蛋白表达量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析显示:TRAF6与NF-κBp65、Act1、IL-6、IL-17、IL-21呈正相关(P<0.05);NF-κBp65与TRAF6、Act1、IL-6、IL-17、IL-21呈正相关(P<0.05);IκBα与NF-κBp65、IL-6、IL-17、IL-21均呈负相关关系(P<0.05)。(4)试验组和对照组治疗后24周后组间对比,试验组PBC患者较对照组Th17细胞表达比率下降更为明显(P=0.038),试验组PBC患者较对照组IL-6、Act1、IL-17水平下降更为明显,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.025,P=0.037),试验组TRAF6、NF-κBp65蛋白表达量较对照组明显下降(P=0.000;P=0.009),IκBα蛋白表达量明显上升(P=0.035),差异有统计学意义。结论1.滋水涵木利胆方联合UDCA与单用UDCA治疗原发性胆汁性胆管炎肝肾阴虚型患者比较,临床疗效更有优势。2.PBC患者外周血Th17细胞表达比率及相关细胞因子IL-6,IL-17,IL-21,IL-23水平明显高于健康组,TGF-β1明显低于健康组。PBC患者的症状可能与IL-6、IL-17、IL-21水平相关,IL-17、IL-6、IL-21与PBC患者胆管上皮细胞损伤的严重程度以及纤维化形成和进展可能关系更密切。IL-6、IL-17、IL-21之间的相关性可能与这些细胞因子的反馈调节有关。3.本研究通过检测PBC患者和健康组外周血Act1、TRAF6、NF-κBp65、IκBα的表达,证明IL-17/Act1/NF-κB信号通路在PBC发病中起着重要作用。4.滋水涵木利胆方可能通过下调IL-6,减少其与TGF-β1的协同作用,抑制Th17细胞的转化和过表达,从而减少Th17相关细胞因子尤其是IL-17的分泌,减弱IL-17/Act1/NF-κB信号传导,最终减轻下游炎症反应的发生。同时,滋水涵木利胆方也可能通过促进IκBα蛋白的合成,重新抑制NF-κB的活性,促进其形成自发负反馈环而减轻肝脏的炎症及胆汁淤积。